Компьютер томографи (КТ)-аар тодорхойлогдсон уушгины зангилааг ялгавартай оношлох нь эмнэлзүйн практикт бэрхшээлтэй хэвээр байна. Энд бид эрүүл хяналтын бүлэг, хоргүй уушгины зангилаа, I үе шатны уушгины аденокарцинома зэрэг 480 сийвэнгийн дээжийн дэлхийн метаболомыг тодорхойлж байна. Аденокарцинома нь өвөрмөц бодисын солилцооны профайлтай байдаг бол хоргүй зангилаа болон эрүүл хүмүүс бодисын солилцооны профайлд өндөр ижил төстэй байдаг. Нээлтийн бүлэгт (n = 306) хоргүй ба хорт хавдрын зангилааг ялгах зорилгоор 27 метаболитын багцыг тодорхойлсон. Дотоод баталгаажуулалт (n = 104) ба гадаад баталгаажуулалт (n = 111) бүлгүүдийн ялгаварлан гадуурхах загварын AUC нь тус тус 0.915 ба 0.945 байв. Замын шинжилгээгээр хоргүй зангилаа болон эрүүл хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад уушгины аденокарциномагийн сийвэн дэх триптофаны хэмжээ буурсантай холбоотой гликолитик метаболитууд нэмэгдсэн болохыг тогтоосон бөгөөд триптофаны шингээлт нь уушгины хорт хавдрын эсүүдэд гликолизийг дэмждэг болохыг харуулж байна. Манай судалгаагаар компьютер томографийн шинжилгээгээр илэрсэн уушгины зангилааны эрсдлийг үнэлэхэд сийвэнгийн метаболитын биомаркеруудын ач холбогдлыг онцолж байна.
Хорт хавдартай өвчтөнүүдийн амьд үлдэх түвшинг сайжруулахын тулд эрт оношлох нь чухал юм. АНУ-ын Үндэсний уушгины хорт хавдрын эрт илрүүлэлтийн туршилт (NLST) болон Европын NELSON судалгааны үр дүнгээс харахад бага тунтай компьютер томографи (LDCT) ашиглан үзлэг хийх нь өндөр эрсдэлтэй бүлгүүдэд уушгины хорт хавдрын нас баралтыг мэдэгдэхүйц бууруулж чадна1,2,3. LDCT-ийг уушгины хорт хавдрын эрт илрүүлэлтэд өргөнөөр ашигласнаас хойш шинж тэмдэггүй уушгины зангилааны рентген зураг дээр санамсаргүй илрэх тохиолдол нэмэгдсээр байна4. Уушгины зангилааг 3 см хүртэл диаметртэй голомтот тунгалаг гэж тодорхойлдог5. Бид хорт хавдрын магадлалыг үнэлэх, LDCT дээр санамсаргүй байдлаар илэрсэн олон тооны уушгины зангилаатай харьцахад бэрхшээлтэй тулгардаг. КТ-ийн хязгаарлалт нь ойр ойрхон үзлэг хийх, хуурамч эерэг үр дүнд хүргэх, шаардлагагүй оролцоо, хэт их эмчилгээ хийхэд хүргэдэг6. Тиймээс уушгины хорт хавдрыг эрт үе шатанд зөв тодорхойлох, анхны илрүүлэлтээр ихэнх хоргүй зангилааг ялгах найдвартай, ашигтай биомаркеруудыг боловсруулах шаардлагатай байна7.
Цусны (ийлдэс, сийвэн, захын цусны мононуклеар эсүүд) цогц молекулын шинжилгээ, түүний дотор геномик, протеомик эсвэл ДНХ-ийн метилжилт8,9,10 нь уушгины хорт хавдрын оношлогооны биомаркеруудыг нээх сонирхлыг нэмэгдүүлэхэд хүргэсэн. Үүний зэрэгцээ, метаболомикийн аргууд нь эндоген болон гадны үйлдлээс хамаардаг эсийн эцсийн бүтээгдэхүүнийг хэмждэг тул өвчний эхлэл болон үр дүнг урьдчилан таамаглахад ашиглагддаг. Шингэн хроматографи-тандем масс спектрометр (LC-MS) нь өндөр мэдрэмжтэй, өргөн динамик хүрээтэй тул метаболомикийн судалгаанд өргөн хэрэглэгддэг арга бөгөөд энэ нь өөр өөр физик-химийн шинж чанартай метаболитуудыг хамарч чаддаг11,12,13. Плазм/ийлдсийн дэлхийн метаболомик шинжилгээг уушгины хорт хавдрын оношлогоо14,15,16,17 болон эмчилгээний үр дүнтэй холбоотой биомаркеруудыг тодорхойлоход ашиглаж байсан ч18 хоргүй ба хортой уушгины зангилааг ялгах сийвэнгийн метаболитын ангилагчийг судлах шаардлагатай хэвээр байна. - асар их судалгаа.
Аденокарцинома болон хавтгай эсийн хавдар нь жижиг эсийн бус уушгины хорт хавдрын (NSCLC) хоёр үндсэн дэд хэлбэр юм. Төрөл бүрийн компьютер томографийн скрининг шинжилгээгээр аденокарцинома нь уушгины хорт хавдрын хамгийн түгээмэл гистологийн төрөл болохыг харуулж байна1,19,20,21. Энэхүү судалгаанд бид эрүүл хяналтын бүлэг, хоргүй уушгины зангилаа, компьютер томографийн шинжилгээгээр илэрсэн ≤3 см зэрэг нийт 695 сийвэнгийн дээжинд метаболомик шинжилгээ хийхдээ хэт өндөр гүйцэтгэлтэй шингэн хроматографи-өндөр нарийвчлалтай масс спектрометр (UPLC-HRMS) ашигласан. I үе шатны уушгины аденокарциномагийн скрининг. Бид уушгины аденокарциномаг хоргүй зангилаа болон эрүүл хяналтын бүлэгээс ялгадаг сийвэнгийн метаболитын бүлгийг тодорхойлсон. Замын баяжуулалтын шинжилгээгээр триптофан болон глюкозын солилцооны хэвийн бус байдал нь хоргүй зангилаа болон эрүүл хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад уушгины аденокарциномад түгээмэл тохиолддог өөрчлөлтүүд болохыг тогтоожээ. Эцэст нь бид LDCT-ээр илэрсэн хорт хавдар болон хоргүй уушгины зангилааг ялгах өндөр өвөрмөц чанар, мэдрэмжтэй сийвэнгийн бодисын солилцооны ангилагчийг бий болгож, баталгаажуулсан бөгөөд энэ нь эрт үеийн ялгавартай оношлогоо, эрсдэлийн үнэлгээнд тусалж болох юм.
Одоогийн судалгаанд хүйс болон насны хувьд тохирсон сийвэнгийн дээжийг 174 эрүүл хяналтын бүлэг, уушгины хоргүй зангилаатай 292 өвчтөн, уушгины аденокарцинома I үе шаттай 229 өвчтөнөөс ретроспектив байдлаар цуглуулсан. 695 хүний хүн ам зүйн шинж чанарыг Нэмэлт Хүснэгт 1-д үзүүлэв.
Зураг 1a-д үзүүлсэнчлэн, Сун Ят-сений Их Сургуулийн Хавдар Судлалын Төвөөс 174 эрүүл хяналтын бүлэг (HC), 170 хоргүй зангилаа (BN), 136 I үе шатны уушгины аденокарцинома (LA) зэрэг нийт 480 сийвэнгийн дээж цуглуулсан. Хэт өндөр гүйцэтгэлтэй шингэн хроматографи-өндөр нарийвчлалтай масс спектрометр (UPLC-HRMS) ашиглан зорилтот бус метаболизмын профайлыг нээх когорт. Нэмэлт Зураг 1-т үзүүлсэнчлэн, ангиллын загварыг бий болгох, дифференциал замын шинжилгээг цаашид судлахын тулд LA болон HC, LA болон BN-ийн хоорондох ялгаатай метаболитуудыг тодорхойлсон. Сун Ят-сений Их Сургуулийн Хавдар Судлалын Төвөөс цуглуулсан 104 дээж, бусад хоёр эмнэлэгээс цуглуулсан 111 дээжийг тус тус дотоод болон гадаад баталгаажуулалтад хамруулсан.
a Хэт өндөр гүйцэтгэлтэй шингэн хроматографи-өндөр нарийвчлалтай масс спектрометр (UPLC-HRMS) ашиглан дэлхийн сийвэнгийн метаболомикийн шинжилгээнд хамрагдсан нээлтийн бүлэгт хамрагдсан судалгааны популяци. b Эрүүл хяналтын бүлэг (HC, n = 174), хоргүй зангилаа (BN, n = 170), I үе шатны уушгины аденокарцинома (Лос Анжелес, n = 136) зэрэг судалгааны бүлэгт хамрагдсан 480 сийвэнгийн дээжийн нийт метаболомын хэсэгчилсэн хамгийн бага квадратын ялгаварлан гадуурхалтын шинжилгээ (PLS-DA). +ESI, эерэг электрошүршигч ионжуулалтын горим, -ESI, сөрөг электрошүршигч ионжуулалтын горим. c–e Өгөгдсөн хоёр бүлэгт мэдэгдэхүйц ялгаатай элбэгшилтэй метаболитууд (хоёр сүүлт Вилкоксоны тэмдэгтэй зэрэглэлийн тест, хуурамч нээлтийн хурдны тохируулсан p утга, FDR <0.05) галт уулын график дээр улаан (нугалалтын өөрчлөлт > 1.2) болон цэнхэр (нугалалтын өөрчлөлт < 0.83) өнгөөр харуулагдсан. ) галт уулын график дээр харуулав. f LA болон BN-ийн хоорондох тэмдэглэгээтэй метаболитын тооны мэдэгдэхүйц ялгааг харуулсан шаталсан кластерын дулааны зураглал. Эх сурвалжийн өгөгдлийг эх сурвалжийн өгөгдлийн файл хэлбэрээр өгдөг.
Нээлтийн бүлгийн 174 HC, 170 BN болон 136 LA-ийн нийт сийвэнгийн метаболомыг UPLC-HRMS шинжилгээг ашиглан шинжилсэн. Бид эхлээд чанарын хяналтын (QC) дээжүүд нь хяналтгүй үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээний (PCA) загварын төвд нягт бөөгнөрдөг болохыг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь одоогийн судалгааны гүйцэтгэлийн тогтвортой байдлыг баталж байна (Нэмэлт Зураг 2).
Зураг 1b-д үзүүлсэнчлэн, эерэг (+ESI) ба сөрөг (−ESI) электрошүршигч ионжуулалтын горимд LA болон BN, LA болон HC-ийн хооронд тодорхой ялгаа байгааг бид тогтоосон. тусгаарлагдсан. Гэсэн хэдий ч +ESI болон -ESI нөхцөлд BN болон HC-ийн хооронд мэдэгдэхүйц ялгаа олдсонгүй.
Бид LA болон HC-ийн хооронд 382 ялгаатай шинж чанар, LA болон BN-ийн хооронд 231 ялгаатай шинж чанар, BN болон HC-ийн хооронд 95 ялгаатай шинж чанарыг олсон (Wilcoxon гарын үсэгтэй зэрэглэлийн тест, FDR <0.05 ба олон өөрчлөлт >1.2 эсвэл <0.83) (Зураг .1c-e). . Оргилуудыг мэдээллийн сан (mzCloud/HMDB/Chemspider сан)-тай харьцуулан m/z утга, хадгалах хугацаа болон хуваагдмал массын спектрийн хайлтаар (дэлгэрэнгүй мэдээллийг Арга зүйн хэсэгт тайлбарласан) 22 нэмэлтээр тэмдэглэсэн. Эцэст нь LA болон BN (Зураг 1f ба Нэмэлт Хүснэгт 2) болон LA болон HC (Нэмэлт Зураг 3 ба Нэмэлт Хүснэгт 2)-ийн хувьд элбэг дэлбэгийн хувьд мэдэгдэхүйц ялгаатай 33 ба 38 тэмдэглэгдсэн метаболитыг тус тус тодорхойлсон. Үүний эсрэгээр, PLS-DA дахь BN болон HC-ийн давхцалтай нийцэж байгаа BN болон HC-д элбэг дэлбэгийн хувьд мэдэгдэхүйц ялгаатай 3 метаболитыг тодорхойлсон (Нэмэлт Хүснэгт 2). Эдгээр ялгаатай метаболитууд нь биохимийн олон төрлийн бодисыг хамардаг (Нэмэлт Зураг 4). Эдгээр үр дүнгүүдийг нэгтгэн авч үзвэл, хоргүй уушгины зангилаа эсвэл эрүүл хүмүүстэй харьцуулахад эрт үеийн уушгины хорт хавдрын хорт хавдрын хувирлыг тусгасан сийвэнгийн метаболомд мэдэгдэхүйц өөрчлөлтүүд гарч байна. Үүний зэрэгцээ, BN болон HC-ийн сийвэнгийн метаболомын ижил төстэй байдал нь хоргүй уушгины зангилаа нь эрүүл хүмүүстэй олон биологийн шинж чанартай байж болохыг харуулж байна. Эпидермисийн өсөлтийн хүчин зүйлийн рецептор (EGFR) генийн мутаци нь уушгины аденокарцинома дэд төрөл 23-т түгээмэл байдаг тул бид жолоочийн мутацийн сийвэнгийн метаболомд үзүүлэх нөлөөллийг тодорхойлохыг зорьсон. Дараа нь бид уушгины аденокарцинома бүлэгт EGFR статустай 72 тохиолдлын нийт метаболомийн профайлыг шинжилсэн. Сонирхолтой нь, бид PCA шинжилгээнд EGFR мутант өвчтөнүүд (n = 41) болон EGFR зэрлэг төрлийн өвчтөнүүд (n = 31) хооронд харьцуулж болох профайлуудыг олсон (Нэмэлт Зураг 5a). Гэсэн хэдий ч бид зэрлэг хэлбэрийн EGFR-тэй өвчтөнүүдтэй харьцуулахад EGFR мутацитай өвчтөнүүдэд элбэг дэлбэг өөрчлөгдсөн 7 метаболитыг тодорхойлсон (t тест, p < 0.05 ба нугалах өөрчлөлт > 1.2 эсвэл < 0.83) (Нэмэлт Зураг 5b). Эдгээр метаболитуудын дийлэнх нь (7-оос 5) нь ацилкарнитин бөгөөд тосны хүчлийн исэлдэлтийн замд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг.
Зураг 2 а-д үзүүлсэн ажлын урсгалд үзүүлсэнчлэн, зангилааны ангиллын биомаркеруудыг хамгийн бага үнэмлэхүй агшилтын операторууд болон LA (n = 136) болон BN (n = 170)-д тодорхойлсон 33 дифференциал метаболит дээр үндэслэн сонголт ашиглан олж авсан. Хувьсагчдын хамгийн сайн хослол (LASSO) – хоёртын логистик регрессийн загвар. Загварын найдвартай байдлыг шалгахын тулд арав дахин хөндлөн баталгаажуулалтыг ашигласан. Хувьсах сонголт болон параметрийн тогтворжуулалтыг λ24 параметртэй магадлалын хамгийн их торгуулиар тохируулсан. Ялгаварлан гадуурхах загварын ангиллын гүйцэтгэлийг шалгахын тулд дэлхийн метаболомик шинжилгээг дотоод баталгаажуулалт (n = 104) болон гадаад баталгаажуулалт (n = 111) бүлгүүдэд бие даан гүйцэтгэсэн. Үүний үр дүнд нээлтийн багцад байгаа 27 метаболитыг хамгийн том дундаж AUC утгатай хамгийн сайн ялгаварлан гадуурхах загвар гэж тодорхойлсон (Зураг 2b), үүнээс 9 нь BN-тэй харьцуулахад LA-д идэвхжил нэмэгдсэн, 18 нь идэвхжил буурсан байна (Зураг 2c).
Уушгины зангилааны ангилагчийг бий болгох ажлын урсгал, үүнд арав дахин хөндлөн баталгаажуулалтаар хоёртын логистик регрессийн загварыг ашиглан нээлтийн багц дахь сийвэнгийн метаболитын хамгийн сайн самбарыг сонгох, дотоод болон гадаад баталгаажуулалтын багц дахь урьдчилан таамаглах гүйцэтгэлийг үнэлэх зэрэг орно. b Бодисын солилцооны биомаркер сонгох LASSO регрессийн загварын хөндлөн баталгаажуулалтын статистик. Дээр өгөгдсөн тоонууд нь өгөгдсөн λ дээр сонгосон биомаркерын дундаж тоог илэрхийлнэ. Улаан цэгэн шугам нь харгалзах ламбда дахь AUC-ийн дундаж утгыг илэрхийлнэ. Саарал алдааны баар нь хамгийн бага ба хамгийн их AUC утгыг илэрхийлнэ. Цэгэн шугам нь 27 сонгосон биомаркертай хамгийн сайн загварыг заана. AUC, хүлээн авагчийн үйл ажиллагааны шинж чанарын (ROC) муруйн доорх талбай. c Нээлтийн бүлгийн BN бүлэгтэй харьцуулахад LA бүлгийн 27 сонгосон метаболитын эвхдэг өөрчлөлт. Улаан багана - идэвхжүүлэлт. Цэнхэр багана нь бууралт юм. d–f Нээлт, дотоод болон гадаад баталгаажуулалтын багц дахь 27 метаболитын хослол дээр үндэслэн ялгаварлан гадуурхах загварын хүчийг харуулсан хүлээн авагчийн үйл ажиллагааны шинж чанарын (ROC) муруй. Эх сурвалжийн өгөгдлийг эх сурвалжийн өгөгдлийн файл хэлбэрээр өгдөг.
Эдгээр 27 метаболитын жигнэсэн регрессийн коэффициентууд дээр үндэслэн таамаглалын загварыг бий болгосон (Нэмэлт Хүснэгт 3). Эдгээр 27 метаболит дээр үндэслэсэн ROC шинжилгээгээр муруйн доорх талбай (AUC) 0.933, нээлтийн бүлгийн мэдрэг чанар 0.868, өвөрмөц чанар 0.859 байсан (Зураг 2d). Үүний зэрэгцээ, LA болон HC-ийн хоорондох 38 тэмдэглэгдсэн ялгаатай метаболитын дунд 16 метаболитын багц нь LA-г HC-ээс ялгахад 0.801 мэдрэг чанар, 0.856 өвөрмөц чанар бүхий 0.902 AUC-д хүрсэн (Нэмэлт Зураг 6a-c). Дифференциал метаболитын янз бүрийн нугалах өөрчлөлтийн босго дээр үндэслэсэн AUC утгыг мөн харьцуулсан. Ангиллын загвар нь нугалах өөрчлөлтийн түвшинг 1.2-оос 1.5 эсвэл 2.0-оор тохируулсан үед LA болон BN (HC)-ийг ялгахад хамгийн сайн ажилласан болохыг бид тогтоосон (Нэмэлт Зураг 7a, b). 27 метаболит бүлэгт суурилсан ангиллын загварыг дотоод болон гадаад когортуудад цаашид баталгаажуулсан. Дотоод баталгаажуулалтын хувьд AUC нь 0.915 (мэдрэг чанар 0.867, өвөрмөц чанар 0.811), гадаад баталгаажуулалтын хувьд 0.945 (мэдрэг чанар 0.810, өвөрмөц чанар 0.979) байв (Зураг 2e, f). Лаборатори хоорондын үр ашгийг үнэлэхийн тулд гадаад когортоос авсан 40 дээжийг Арга зүйн хэсэгт тайлбарласны дагуу гадаад лабораторид шинжилсэн. Ангиллын нарийвчлал нь AUC 0.925-д хүрсэн (Нэмэлт Зураг 8). Уушгины хавтгай эсийн хавдар (LUSC) нь уушгины аденокарцинома (LUAD)-ын дараа жижиг эсийн бус уушгины хорт хавдрын (NSCLC) хоёр дахь хамгийн түгээмэл дэд төрөл тул бид бодисын солилцооны профайлын баталгаажсан боломжит ашиг тусыг мөн туршсан. BN болон LUSC-ийн 16 тохиолдол. LUSC болон BN-ийн хоорондох ялгах AUC нь 0.776 байсан (Нэмэлт Зураг 9), энэ нь LUAD болон BN-ийн хоорондох ялгахтай харьцуулахад чадвар муу байгааг харуулж байна.
Судалгаагаар КТ зураг дээрх зангилааны хэмжээ нь хорт хавдрын магадлалтай эерэг хамааралтай бөгөөд зангилааны эмчилгээний гол хүчин зүйл хэвээр байгааг харуулсан25,26,27. NELSON скрининг судалгааны томоохон бүлгийн өгөгдлийн шинжилгээгээр зангилаа <5 мм-тэй хүмүүст хорт хавдрын эрсдэл нь зангилаагүй хүмүүст ч мөн адил байсан28. Тиймээс тогтмол КТ хяналт шаардлагатай хамгийн бага хэмжээ нь Британийн Цээжний Нийгэмлэг (BTS)-ийн зөвлөсний дагуу 5 мм, Флейшнерийн Нийгэмлэгийн зөвлөсний дагуу 6 мм29 байна. Гэсэн хэдий ч 6 мм-ээс том хэмжээтэй, тодорхойгүй уушгины зангилаа (IPN) гэж нэрлэгддэг тодорхойгүй хоргүй шинж тэмдэггүй зангилаа нь эмнэлзүйн практикт үнэлгээ, менежментийн томоохон бэрхшээл хэвээр байна30,31. Дараа нь бид нээлтийн болон дотоод баталгаажуулалтын когортуудаас цуглуулсан дээжийг ашиглан зангилааны хэмжээ нь бодисын солилцооны гарын үсэгт нөлөөлсөн эсэхийг судалсан. 27 баталгаажсан биомаркер дээр анхаарлаа төвлөрүүлж, бид эхлээд HC болон BN дэд 6 мм метаболомуудын PCA профайлыг харьцуулсан. Бид HC болон BN-ийн өгөгдлийн ихэнх цэгүүд давхцаж байгааг тогтоосон бөгөөд энэ нь хоёр бүлэгт сийвэнгийн метаболитын түвшин ижил төстэй байгааг харуулж байна (Зураг 3a). BN болон LA-д өөр өөр хэмжээтэй мужуудын онцлог шинж чанарын зураглал хадгалагдсан хэвээр байсан (Зураг 3b, c), харин 6-20 мм-ийн хүрээнд хорт хавдар болон хоргүй зангилааны хооронд ялгаа ажиглагдсан (Зураг 3d). Энэ бүлэг нь 6-20 мм хэмжээтэй зангилааны хорт хавдрыг урьдчилан таамаглахад AUC 0.927, өвөрмөц чанар 0.868, мэдрэг чанар 0.820 байсан (Зураг 3e, f). Бидний үр дүнгээс харахад ангилагч нь зангилааны хэмжээнээс үл хамааран эрт үеийн хорт хавдрын өөрчлөлтөөс үүдэлтэй бодисын солилцооны өөрчлөлтийг барьж чаддаг болохыг харуулж байна.
ad 27 метаболитын бодисын солилцооны ангилагч дээр үндэслэн тодорхой бүлгүүдийн хоорондох PCA профайлыг харьцуулсан. CC ба BN < 6 мм. b BN < 6 мм ба BN 6–20 мм. LA 6–20 мм-д LA 20–30 мм-тэй харьцуулахад. g BN 6–20 мм ба LA 6–20 мм. GC, n = 174; BN < 6 мм, n = 153; BN 6–20 мм, n = 91; LA 6–20 мм, n = 89; LA 20–30 мм, n = 77. e 6–20 мм-ийн зангилааны ялгаварлан гадуурхах загварын гүйцэтгэлийг харуулсан хүлээн авагчийн үйл ажиллагааны шинж чанар (ROC) муруй. f Магадлалын утгыг 6–20 мм-ийн хэмжээтэй зангилааны логистик регрессийн загварт үндэслэн тооцоолсон. Саарал цэгтэй шугам нь оновчтой таслалтын утгыг (0.455) илэрхийлнэ. Дээрх тоонууд нь Лос Анжелес хотод тохиолдох тохиолдлын хувийг илэрхийлнэ. Хоёр талт Оюутны t тестийг ашиглана уу. PCA, үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээ. Муруй доорх AUC талбай. Эх сурвалжийн өгөгдлийг эх сурвалжийн өгөгдлийн файл хэлбэрээр өгнө.
Санал болгож буй хорт хавдрын урьдчилсан таамаглалын загварын гүйцэтгэлийг харуулахын тулд уушгины зангилааны ижил хэмжээтэй (7-9 мм) дөрвөн дээжийг (44-61 насны) сонгосон (Зураг 4a, b). Анхны үзлэгээр 1-р тохиолдол нь хоргүй хавдартай холбоотой шинж тэмдэг бүхий шохойжилттой хатуу зангилаа хэлбэрээр илэрсэн бол 2-р тохиолдол нь тодорхойгүй хэсэгчилсэн хатуу зангилаа, тодорхойгүй шинж тэмдэггүй байдлаар илэрсэн. Дараагийн гурван удаагийн компьютер томографийн шинжилгээгээр эдгээр тохиолдлууд 4 жилийн хугацаанд тогтвортой хэвээр байсан тул хоргүй зангилаа гэж тооцогддог болохыг харуулсан (Зураг 4a). Цуврал компьютер томографийн клиник үнэлгээтэй харьцуулахад одоогийн ангилагч загвартай нэг удаагийн сийвэнгийн метаболитын шинжилгээ нь магадлалын хязгаарлалтын үндсэн дээр эдгээр хоргүй зангилааг хурдан бөгөөд зөв тодорхойлсон (Хүснэгт 1). 3-р тохиолдлын 4b зурагт гялтангийн таталтын шинж тэмдэг бүхий зангилааг харуулсан бөгөөд энэ нь ихэвчлэн хорт хавдартай холбоотой байдаг32. 4-р тохиолдол нь хоргүй шалтгааны нотолгоогүй тодорхойгүй хэсэгчилсэн хатуу зангилаа хэлбэрээр илэрсэн. Эдгээр бүх тохиолдлыг ангилагчийн загварын дагуу хорт хавдар гэж таамагласан (Хүснэгт 1). Уушгины аденокарциномагийн үнэлгээг уушгины резекцийн мэс заслын дараах гистопатологийн шинжилгээгээр харуулсан (Зураг 4b). Гадны баталгаажуулалтын багцын хувьд бодисын солилцооны ангилагч нь 6 мм-ээс том хэмжээтэй тодорхойгүй уушгины зангилааны хоёр тохиолдлыг нарийвчлалтай таамагласан (Нэмэлт Зураг 10).
Хоргүй зангилааны хоёр тохиолдлын уушгины тэнхлэгийн цонхны компьютер томографийн зураг. 1-р тохиолдолд, 4 жилийн дараа компьютер томографийн зураг авахад баруун доод дэлбээнд шохойжилттой 7 мм хэмжээтэй тогтвортой хатуу зангилаа илэрсэн. 2-р тохиолдолд, 5 жилийн дараа компьютер томографийн зураг авахад баруун дээд дэлбээнд 7 мм диаметртэй тогтвортой, хагас хатуу зангилаа илэрсэн. b Уушгины тэнхлэгийн цонхтой компьютер томографийн зураг болон уушгины тайралтаас өмнөх I үе шатны аденокарциномагийн хоёр тохиолдлын харгалзах эмгэг судлалын судалгаа. 3-р тохиолдолд баруун дээд дэлбээнд 8 мм диаметртэй, гялтангийн таталттай зангилаа илэрсэн. 4-р тохиолдолд зүүн дээд дэлбээнд 9 мм хэмжээтэй хагас хатуу нунтаг шилэн зангилаа илэрсэн. Таслагдсан уушгины эдийн гематоксилин ба эозин (H&E) будалт (масштабын бар = 50 μм) нь уушгины аденокарциномагийн ацинар өсөлтийн хэв маягийг харуулж байна. Сумнууд нь компьютер томографийн зураг дээр илэрсэн зангилааг заана. H&E зургууд нь эмгэг судлаачийн шалгасан олон (>3) микроскопийн талбайн төлөөллийн зургууд юм.
Бидний үр дүнгүүдийг нэгтгэн дүгнэхэд уушгины зангилааны ялгавартай оношлогоонд сийвэнгийн метаболитын биомаркеруудын боломжит үнэ цэнийг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь компьютер томографийн шинжилгээг үнэлэхэд бэрхшээл учруулж болзошгүй юм.
Баталгаажсан дифференциал метаболит самбар дээр үндэслэн бид бодисын солилцооны гол өөрчлөлтүүдийн биологийн хамаарлыг тодорхойлохыг эрэлхийлсэн. MetaboAnalyst-ийн KEGG замын баяжуулалтын шинжилгээгээр өгөгдсөн хоёр бүлгийн хооронд 6 нийтлэг мэдэгдэхүйц өөрчлөгдсөн замыг тодорхойлсон (LA vs. HC болон LA vs. BN, тохируулсан p ≤ 0.001, нөлөө > 0.01). Эдгээр өөрчлөлтийг пируват бодисын солилцоо, триптофаны бодисын солилцоо, ниацин ба никотинамидын бодисын солилцоо, гликолиз, TCA мөчлөг, пурины бодисын солилцооны эмгэгүүдээр тодорхойлсон (Зураг 5a). Дараа нь бид үнэмлэхүй тоон үзүүлэлтийг ашиглан томоохон өөрчлөлтүүдийг баталгаажуулахын тулд зорилтот метаболомикийг хийсэн. Жинхэнэ метаболитын стандартыг ашиглан гурвалсан квадрупол масс спектрометр (QQQ) ашиглан нийтлэг өөрчлөгдсөн замууд дахь нийтлэг метаболитуудыг тодорхойлох. Метаболомик судалгааны зорилтот түүврийн хүн ам зүйн шинж чанарыг Нэмэлт Хүснэгт 4-т оруулсан болно. Бидний дэлхийн метаболомикийн үр дүнтэй нийцүүлэн тоон шинжилгээгээр гипоксантин ба ксантин, пируват, лактатын хэмжээ BN болон HC-тэй харьцуулахад LA-д ихэссэн болохыг баталсан (Зураг 5b, c, p <0.05). Гэсэн хэдий ч BN болон HC-ийн хооронд эдгээр метаболитуудад мэдэгдэхүйц ялгаа ажиглагдаагүй.
LA бүлэгт BN болон HC бүлгүүдтэй харьцуулахад мэдэгдэхүйц ялгаатай метаболитуудын KEGG замын баяжуулалтын шинжилгээ. Хоёр сүүлт Глобал тестийг ашигласан бөгөөд p утгыг Холм-Бонферрони аргыг ашиглан тохируулсан (тохируулсан p ≤ 0.001 ба нөлөөллийн хэмжээ > 0.01). b–d Хийл графикууд нь LC-MS/MS-ээр тодорхойлогдсон сийвэнгийн HC, BN, LA дахь гипоксантин, ксантин, лактат, пируват, триптофаны түвшинг харуулж байна (бүлэг тус бүрт n = 70). Цагаан ба хар цэгтэй шугамууд нь медиан ба квартилийг тус тус заана. e LUAD-TCGA өгөгдлийн багцад хэвийн уушгины эдтэй (n = 59) харьцуулахад уушгины аденокарцинома дахь SLC7A5 ба QPRT-ийн хэвийн Log2TPM (сая тутамд транскрипт) mRNA экспрессийг (n = 513) харуулж байна. Цагаан хайрцаг нь квартил хоорондын хүрээг, төвд байрлах хэвтээ хар шугам нь медианыг, хайрцагнаас сунаж тогтсон босоо хар шугам нь 95%-ийн итгэх интервалыг (CI) илэрхийлнэ. f TCGA өгөгдлийн багц дахь уушгины аденокарцинома (n = 513) болон хэвийн уушгины эд (n = 59)-д SLC7A5 болон GAPDH-ийн экспрессийн Пирсоны корреляцийн график. Саарал хэсэг нь 95%-ийн CI-г илэрхийлнэ. r, Пирсоны корреляцийн коэффициент. g LC-MS/MS-ээр тодорхойлогдсон өвөрмөц бус shRNA хяналт (NC) болон shSLC7A5 (Sh1, Sh2)-ээр трансфекцлагдсан A549 эсийн эсийн триптофаны хэвийн түвшин. Бүлэг тус бүрийн биологийн хувьд бие даасан таван дээжийн статистик шинжилгээг үзүүлэв. h A549 эс (NC) болон SLC7A5 нокаутын A549 эсүүд (Sh1, Sh2)-д NADt-ийн эсийн түвшин (нийт NAD, үүнд NAD+ болон NADH орно). Бүлэг тус бүрийн биологийн хувьд бие даасан гурван дээжийн статистик шинжилгээг үзүүлэв. i SLC7A5-ийн нокдаун хийхээс өмнө болон дараа A549 эсийн гликолитик идэвхжлийг эсийн гаднах хүчиллэгжилтийн хурд (ECAR)-аар хэмжсэн (бүлэг тус бүрт n = 4 биологийн хувьд бие даасан дээж). 2-DG, 2-дезокси-D-глюкоз. Хоёр сүүлт Стьютдийн t тестийг (b–h)-д ашигласан. (g–i)-д алдааны мөрүүд дундаж ± SD-г илэрхийлж, туршилт бүрийг гурван удаа бие даан гүйцэтгэсэн бөгөөд үр дүн нь ижил төстэй байв. Эх сурвалжийн өгөгдлийг эх сурвалжийн өгөгдлийн файл хэлбэрээр өгсөн болно.
LA бүлэгт триптофаны солилцоо өөрчлөгдсөний мэдэгдэхүйц нөлөөллийг харгалзан бид QQQ ашиглан HC, BN, LA бүлгүүдийн сийвэн дэх триптофаны түвшинг үнэлсэн. Бид LA-д сийвэн дэх триптофаны хэмжээ HC эсвэл BN-тэй харьцуулахад буурсан болохыг тогтоосон (p < 0.001, Зураг 5d), энэ нь хяналтын бүлгийн эрүүл хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад уушгины хорт хавдартай өвчтөнүүдэд цусны эргэлтийн триптофаны түвшин бага байдаг гэсэн өмнөх олдворуудтай нийцэж байна33,34,35. PET/CT индикатор 11C-метил-L-триптофан ашиглан хийсэн өөр нэг судалгаагаар уушгины хорт хавдрын эдэд триптофаны дохиог хадгалах хугацаа нь хоргүй гэмтэл эсвэл хэвийн эдтэй харьцуулахад мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн болохыг тогтоожээ36. LA сийвэн дэх триптофаны хэмжээ буурах нь уушгины хорт хавдрын эсүүдээр идэвхтэй триптофаны шингээлтийг тусгаж магадгүй гэж бид таамаглаж байна.
Триптофаны катаболизмын кинуренины замын эцсийн бүтээгдэхүүн нь гликолизийн үед глицеральдегид-3-фосфатыг 1,3-бисфосфоглицераттай урвалд оруулах чухал субстрат болох NAD+37,38 гэдгийг мөн мэддэг39. Өмнөх судалгаанууд дархлааны зохицуулалтад триптофаны катаболизмын гүйцэтгэх үүргийг анхаарч байсан бол бид одоогийн судалгаанд ажиглагдсан триптофаны зохицуулалтын алдагдал ба гликолитик замын хоорондын харилцан үйлчлэлийг тодруулахыг эрэлхийлсэн. Ууссан бодисын тээвэрлэгчийн 7-р бүлгийн 5-р гишүүн (SLC7A5) нь триптофаны тээвэрлэгч гэдгээрээ алдартай43,44,45. Хинолин хүчлийн фосфорибосилтрансфераза (QPRT) нь кинуренины замын доод хэсэгт байрладаг бөгөөд хинолин хүчлийг NAMN46 болгон хувиргадаг фермент юм. LUAD TCGA өгөгдлийн багцыг шалгахад SLC7A5 болон QPRT хоёулаа хэвийн эдтэй харьцуулахад хавдрын эдэд мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн болохыг тогтоожээ (Зураг 5e). Энэхүү өсөлт нь уушгины аденокарциномагийн I ба II үе шатууд болон III ба IV үе шатуудад ажиглагдсан (Нэмэлт Зураг 11) бөгөөд энэ нь хавдар үүсэхтэй холбоотой триптофаны солилцооны эрт үеийн эмгэгийг харуулж байна.
Үүнээс гадна, LUAD-TCGA өгөгдлийн багц нь хорт хавдартай өвчтөнүүдийн дээжинд SLC7A5 болон GAPDH mRNA экспрессийн хооронд эерэг хамаарал байгааг харуулсан (r = 0.45, p = 1.55E-26, Зураг 5f). Үүний эсрэгээр хэвийн уушгины эдэд ийм генийн гарын үсгийн хооронд мэдэгдэхүйц хамаарал олдсонгүй (r = 0.25, p = 0.06, Зураг 5f). A549 эсүүдэд SLC7A5-ийг (Нэмэлт Зураг 12) нокдаун хийх нь эсийн триптофан болон NAD(H) түвшинг мэдэгдэхүйц бууруулсан (Зураг 5g,h) бөгөөд эсийн гаднах хүчиллэгжилтийн хурдаар (ECAR) хэмжигдсэн гликолитик идэвхжил буурсан (Зураг 1). 5i). Тиймээс сийвэн дэх бодисын солилцооны өөрчлөлт болон in vitro илрүүлэлт дээр үндэслэн триптофаны солилцоо нь кинуренины замаар NAD+ үүсгэж, уушгины хорт хавдрын гликолизийг дэмжихэд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг гэж бид таамаглаж байна.
Судалгаагаар LDCT-ээр илэрсэн олон тооны тодорхойгүй уушгины зангилаа нь хорт хавдрын хуурамч эерэг оношлогдсоны улмаас PET-CT, уушгины биопси, хэт эмчилгээ зэрэг нэмэлт шинжилгээ хийх шаардлагатай болж болзошгүйг харуулсан.31 Зураг 6-д үзүүлсэнчлэн, бидний судалгаагаар эрсдэлийн давхаргажилт болон КТ-ээр илэрсэн уушгины зангилааны дараагийн менежментийг сайжруулж болох оношлогооны ач холбогдолтой сийвэнгийн метаболитын бүлгийг тодорхойлсон.
Уушгины зангилааг хоргүй эсвэл хортой шалтгааныг илтгэх дүрслэлийн шинж чанартай бага тунгаар компьютер томографи (LDCT) ашиглан үнэлдэг. Зангилааны тодорхойгүй үр дүн нь ойр ойрхон үзлэг, шаардлагагүй оролцоо, хэт их эмчилгээ хийхэд хүргэдэг. Оношилгооны ач холбогдолтой сийвэнгийн бодисын солилцооны ангилагчийг оруулах нь уушгины зангилааны эрсдэлийн үнэлгээ болон дараагийн менежментийг сайжруулж болзошгүй. ПЭТ позитрон ялгаралтын томографи.
АНУ-ын NLST судалгаа болон Европын NELSON судалгааны мэдээллээс харахад өндөр эрсдэлтэй бүлгүүдийг бага тунтай компьютер томографи (LDCT)-ээр илрүүлэх нь уушгины хорт хавдрын нас баралтыг бууруулж болзошгүйг харуулж байна1,3. Гэсэн хэдий ч LDCT-ээр илэрсэн олон тооны санамсаргүй уушгины зангилааны эрсдэлийн үнэлгээ болон дараагийн эмнэлзүйн менежмент нь хамгийн хэцүү хэвээр байна. Гол зорилго нь найдвартай биомаркеруудыг нэгтгэснээр одоо байгаа LDCT дээр суурилсан протоколуудын зөв ангиллыг оновчтой болгох явдал юм.
Уушгины хорт хавдрыг эрүүл хяналтын бүлэгтэй харьцуулж цусны метаболит гэх мэт тодорхой молекулын биомаркеруудыг тодорхойлсон15,17. Одоогийн судалгаанд бид LDCT-ээр санамсаргүй илрүүлсэн хоргүй болон хортой уушгины зангилааг ялгахын тулд сийвэнгийн метаболомикийн шинжилгээг ашиглахад анхаарлаа хандуулсан. Бид UPLC-HRMS шинжилгээг ашиглан эрүүл хяналтын бүлэг (HC), хоргүй уушгины зангилаа (BN), I үе шатны уушгины аденокарцинома (LA)-ийн дээжийн дэлхийн сийвэнгийн метаболомыг харьцуулсан. Бид HC болон BN нь бодисын солилцооны ижил төстэй профайлтай байсан бол LA нь HC болон BN-тэй харьцуулахад мэдэгдэхүйц өөрчлөлттэй болохыг тогтоосон. Бид LA-г HC болон BN-ээс ялгадаг хоёр багц сийвэнгийн метаболитыг тодорхойлсон.
Хоргүй болон хорт хавдрын одоогийн LDCT дээр суурилсан тодорхойлох схем нь голчлон зангилааны хэмжээ, нягтрал, морфологи, цаг хугацааны явцад үүсэх өсөлтийн хурдад суурилдаг30. Өмнөх судалгаагаар зангилааны хэмжээ нь уушгины хорт хавдар тусах магадлалтай нягт холбоотой болохыг харуулсан. Өндөр эрсдэлтэй өвчтөнүүдэд ч гэсэн <6 мм зангилаанд хорт хавдар үүсэх эрсдэл <1% байдаг. 6-20 мм хэмжээтэй зангилааны хорт хавдрын эрсдэл 8%-64% хооронд хэлбэлздэг30. Тиймээс Флейшнерийн нийгэмлэг нь тогтмол компьютер томографийн хяналтанд 6 мм-ийн таслах диаметртэй байхыг зөвлөж байна.29 Гэсэн хэдий ч 6 мм-ээс том хэмжээтэй тодорхойгүй уушгины зангилааны (IPN) эрсдэлийн үнэлгээ, менежментийг хангалттай хийгдээгүй байна31. Төрөлхийн зүрхний өвчний одоогийн менежмент нь ихэвчлэн компьютер томографийн хяналтыг байнга хянаж, анхааралтай хүлээхэд суурилдаг.
Баталгаажсан метаболом дээр үндэслэн бид анх удаа эрүүл хүмүүс болон хоргүй зангилаанууд <6 мм-ийн хоорондох метаболомийн шинж тэмдгүүдийн давхцлыг харуулсан. Биологийн ижил төстэй байдал нь зангилаанууд <6 мм-ийн хувьд хорт хавдрын эрсдэл нь зангилаагүй хүмүүстэй адил бага гэсэн өмнөх КТ-ийн олдворуудтай нийцэж байна.30 Бидний үр дүнгээс харахад хоргүй зангилаанууд <6 мм ба ≥6 мм нь бодисын солилцооны профайлд өндөр ижил төстэй байдаг бөгөөд энэ нь хоргүй шалтгааны функциональ тодорхойлолт нь зангилааны хэмжээнээс үл хамааран тогтвортой байгааг харуулж байна. Тиймээс орчин үеийн оношлогооны сийвэнгийн метаболитын самбарууд нь зангилааг КТ дээр анх илрүүлэх үед нэг шинжилгээг хасах тест болгон өгч, цуврал хяналтыг бууруулж болзошгүй юм. Үүний зэрэгцээ, бодисын солилцооны биомаркеруудын ижил самбар нь ≥6 мм хэмжээтэй хорт хавдрын зангилааг хоргүй зангилаанаас ялгаж, ижил хэмжээтэй IPN болон КТ зураг дээрх тодорхойгүй морфологийн шинж чанаруудын талаар нарийвчлалтай таамаглал дэвшүүлсэн. Энэхүү сийвэнгийн солилцооны ангилагч нь ≥6 мм хэмжээтэй зангилааны хорт хавдрын талаар 0.927 AUC-тайгаар урьдчилан таамаглахад сайн ажилласан. Бидний үр дүнгүүдийг нэгтгэн үзвэл, сийвэнгийн бодисын солилцооны өвөрмөц шинж тэмдгүүд нь хавдрын эхэн үеийн бодисын солилцооны өөрчлөлтийг тусгаж, зангилааны хэмжээнээс үл хамааран эрсдэлийн урьдчилсан хүчин зүйл болж болзошгүйг харуулж байна.
Уушгины аденокарцинома (LUAD) болон хавтгай хучуур эдийн хавдар (LUSC) нь жижиг эсийн бус уушгины хорт хавдрын (NSCLC) гол төрөл юм. LUSC нь тамхины хэрэглээтэй нягт холбоотой47 бөгөөд LUAD нь компьютер томографийн шинжилгээгээр илэрсэн санамсаргүй уушгины зангилааны хамгийн түгээмэл гистологи48 гэдгийг харгалзан үзвэл бидний ангилагч загварыг I үе шатны аденокарцинома дээжинд тусгайлан бүтээсэн. Ван болон түүний хамтрагчид мөн LUAD дээр анхаарлаа төвлөрүүлж, эрт үеийн уушгины хорт хавдрыг эрүүл хүмүүсээс ялгахын тулд липидомик ашиглан есөн липидийн гарын үсгийг тодорхойлсон17. Бид одоогийн ангилагч загварыг I үе шатны LUSC-ийн 16 тохиолдол болон 74 хоргүй зангилаа дээр туршиж, LUSC-ийн таамаглалын нарийвчлал бага байгааг (AUC 0.776) ажигласан нь LUAD болон LUSC нь өөрийн гэсэн бодисын солилцооны гарын үсэгтэй байж болохыг харуулж байна. Үнэндээ LUAD болон LUSC нь шалтгаан, биологийн гарал үүсэл, генетикийн гажигаараа ялгаатай болохыг харуулсан49. Тиймээс уушгины хорт хавдрыг илрүүлэх скрининг хөтөлбөрт хүн амд суурилсан сургалтын загварт бусад төрлийн гистологийн шинжилгээг оруулах хэрэгтэй.
Энд бид эрүүл хяналтын бүлэг болон хоргүй зангилаатай харьцуулахад уушгины аденокарцинома өвчний хамгийн их өөрчлөгддөг зургаан замыг тодорхойлсон. Ксантин ба гипоксантин нь пурины солилцооны замын нийтлэг метаболит юм. Бидний үр дүнтэй нийцэж байгаачлан, эрүүл хяналтын бүлэг эсвэл инвазив өмнөх үе шаттай өвчтөнүүдтэй харьцуулахад уушгины аденокарциноматай өвчтөнүүдийн сийвэн эсвэл эдэд пурины солилцоотой холбоотой завсрын бодисууд мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн байна15,50. Сийвэн дэх ксантин ба гипоксантины түвшин өндөр байх нь хорт хавдрын эсүүд хурдан үржихэд шаардлагатай анаболизмыг тусгаж болно. Глюкозын солилцооны зохицуулалт алдагдах нь хорт хавдрын солилцооны сайн мэддэг шинж тэмдэг юм51. Энд бид HC болон BN бүлэгтэй харьцуулахад LA бүлэгт пируват ба лактатын мэдэгдэхүйц өсөлтийг ажигласан бөгөөд энэ нь жижиг эсийн бус уушгины хорт хавдар (NSCLC) өвчтөнүүд болон эрүүл хяналтын бүлгийн сийвэнгийн метаболомын профайлд гликолитик замын гажиг үүссэн талаарх өмнөх тайлангуудтай нийцэж байна. үр дүн нь тогтвортой байна52,53.
Чухал зүйл бол бид уушгины аденокарциномагийн сийвэн дэх пируват ба триптофаны солилцооны хооронд урвуу хамаарлыг ажигласан. LA бүлэгт сийвэн дэх триптофаны түвшин HC эсвэл BN бүлэгтэй харьцуулахад буурсан байна. Сонирхолтой нь, өмнө нь проспектив когорт ашиглан хийсэн томоохон хэмжээний судалгаагаар цусны эргэлтэнд байгаа триптофаны түвшин бага байх нь уушгины хорт хавдрын эрсдэл нэмэгдэхтэй холбоотой болохыг тогтоожээ 54. Триптофан бол бидний хоол хүнснээс бүрэн авдаг чухал амин хүчил юм. Уушгины аденокарцинома дахь сийвэн дэх триптофаны хомсдол нь энэхүү метаболитын хурдацтай хомсдолыг харуулж байж болзошгүй гэж бид дүгнэж байна. Кинуренины замаар дамжин триптофаны катаболизмын эцсийн бүтээгдэхүүн нь de novo NAD+ нийлэгжилтийн эх үүсвэр болдог нь сайн мэдэгдэж байна. NAD+ нь голчлон аврах замаар үүсдэг тул эрүүл мэнд, өвчний үед триптофаны солилцоонд NAD+-ийн ач холбогдлыг тодорхойлох шаардлагатай хэвээр байна46. TCGA мэдээллийн сангийн бидний дүн шинжилгээгээр триптофаны тээвэрлэгч уусмалын тээвэрлэгч 7A5 (SLC7A5)-ийн илэрхийлэл нь хэвийн хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад уушгины аденокарциномад мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн бөгөөд гликолитик фермент GAPDH-ийн илэрхийлэлтэй эерэг хамааралтай болохыг харуулсан. Өмнөх судалгаанууд нь голчлон триптофаны катаболизмын хавдрын эсрэг дархлааны хариу урвалыг дарангуйлах үүрэгт анхаарлаа хандуулсан40,41,42. Энд бид уушгины хорт хавдрын эсүүдэд SLC7A5-ийг нокдаун хийснээр триптофаны шингээлтийг дарангуйлах нь эсийн NAD түвшин буурч, гликолитик идэвхжил буурахад хүргэдэг болохыг харуулж байна. Товчхондоо, бидний судалгаа нь уушгины аденокарциномагийн хорт хавдрын өөрчлөлттэй холбоотой сийвэнгийн солилцооны өөрчлөлтийн биологийн үндэслэлийг өгдөг.
EGFR мутаци нь NSCLC-тэй өвчтөнүүдийн хамгийн түгээмэл хөдөлгөгч мутаци юм. Бидний судалгаагаар EGFR мутацитай өвчтөнүүд (n = 41) нь зэрлэг хэлбэрийн EGFR (n = 31)-тэй өвчтөнүүдтэй ерөнхий метаболизмын профайлтай төстэй байсан боловч ацилкарнитинтай өвчтөнүүдэд зарим EGFR мутант өвчтөнүүдийн сийвэнгийн түвшин буурсан болохыг тогтоосон. Ацилкарнитины тогтсон үүрэг бол ацил бүлгийг цитоплазмаас митохондрийн матриц руу зөөвөрлөх явдал бөгөөд энэ нь өөх тосны хүчлийг исэлдүүлж энерги үүсгэдэг 55 юм. Бидний олдворуудтай нийцүүлэн саяхны нэгэн судалгаагаар 102 уушгины аденокарцинома эдийн дээжийн дэлхийн метаболомыг шинжилснээр EGFR мутант ба EGFR зэрлэг хэлбэрийн хавдрын хооронд ижил төстэй метаболомын профайлыг тогтоосон50. Сонирхолтой нь, ацилкарнитины агууламж EGFR мутант бүлэгт мөн илэрсэн. Тиймээс ацилкарнитины түвшний өөрчлөлт нь EGFR-ээр өдөөгдсөн бодисын солилцооны өөрчлөлт болон үндсэн молекулын замыг тусгаж байгаа эсэх нь цаашид судлах шаардлагатай байж магадгүй юм.
Эцэст нь хэлэхэд, бидний судалгаагаар уушгины зангилааны ялгавартай оношлогоонд зориулсан сийвэнгийн бодисын солилцооны ангилагчийг тогтоож, компьютер томографийн шинжилгээнд үндэслэн эрсдэлийн үнэлгээг оновчтой болгож, эмнэлзүйн менежментийг хөнгөвчлөх ажлын урсгалыг санал болгож байна.
Энэхүү судалгааг Сун Ятсений Их Сургуулийн Хавдрын Эмнэлэг, Сун Ятсений Их Сургуулийн Нэгдүгээр Хамтын Эмнэлэг, Жэнжоугийн Их Сургуулийн Хавдрын Эмнэлэгийн Ёс зүйн Хороо баталсан. Нээлтийн болон дотоод баталгаажуулалтын бүлгүүдэд Сун Ятсений Их Сургуулийн Хавдрын Төвийн Хавдрын Хяналт ба Урьдчилан Сэргийлэх Хэлтэст жил бүр эмнэлгийн үзлэгт хамрагдаж буй хүмүүсээс эрүүл хүмүүсээс 174 ийлдэс, хоргүй зангилаанаас 244 ийлдэс, мөн Сун Ятсений Их Сургуулийн Хавдрын Төвөөс 166 хоргүй зангилаа цуглуулсан. ийлдэс. I шатны уушгины аденокарциномаг Сун Ятсений Их Сургуулийн Хавдрын Төвөөс цуглуулсан. Гадны баталгаажуулалтын бүлэгт хоргүй зангилааны 48 тохиолдол, Сун Ятсений Их Сургуулийн Нэгдүгээр Хамтын Эмнэлгээс I шатны уушгины аденокарциномагийн 39 тохиолдол, Жэнжоугийн Хавдрын Эмнэлгээс I шатны уушгины аденокарциномагийн 24 тохиолдол багтсан. Сунь Ят-сений Их Сургуулийн Хорт Хавдрын Төв нь тогтоосон бодисын солилцооны ангилагчийн оношлогооны чадварыг шалгахын тулд I үе шатны хавтгай эсийн уушгины хорт хавдрын 16 тохиолдлыг цуглуулсан (өвчтөний шинж чанарыг Нэмэлт Хүснэгт 5-д үзүүлэв). Нээлтийн когорт болон дотоод баталгаажуулалтын когортоос дээжийг 2018 оны 1-р сараас 2020 оны 5-р сарын хооронд цуглуулсан. Гадаад баталгаажуулалтын когортын дээжийг 2021 оны 8-р сараас 2022 оны 10-р сарын хооронд цуглуулсан. Хүйсийн ялгаварлан гадуурхалтыг багасгахын тулд когорт бүрт ойролцоогоор тэнцүү тооны эрэгтэй, эмэгтэй тохиолдлыг хуваарилсан. Нээлтийн баг болон Дотоод хяналтын баг. Оролцогчийн хүйсийг өөрийн тайланд үндэслэн тодорхойлсон. Бүх оролцогчдоос мэдээлэлтэй зөвшөөрөл авсан бөгөөд нөхөн төлбөр олгоогүй. Хоргүй зангилаатай хүмүүс нь шинжилгээ хийх үед 2-5 жилийн хугацаанд тогтвортой компьютер томографийн оноотой хүмүүс байсан бөгөөд мэс заслын өмнө цуглуулж, гистопатологийн шинжилгээгээр оношлогдсон гадны баталгаажуулалтын дээжээс 1 тохиолдлоос бусад тохиолдолд. Архаг бронхитоос бусад тохиолдолд уушгины аденокарциномагийн тохиолдлыг уушгины мэс заслын өмнө цуглуулж, эмгэг судлалын оношлогоогоор баталгаажуулсан. Мацаг барих цусны дээжийг антикоагулянтгүйгээр сийвэнгийн ялгах хоолойд цуглуулсан. Цусны дээжийг өрөөний температурт 1 цагийн турш бүлэгнүүлж, дараа нь 2851 × g-д 4°C-д 10 минутын турш центрифугээр ялгаж, сийвэнгийн дээд давхаргыг цуглуулсан. Сийвэнгийн аликвотыг метаболит гаргаж авах хүртэл -80°C-д хөлдөөсөн. Сунь Ят-сений Их Сургуулийн Хавдар Судлалын Төвийн Хорт Хавдраас Урьдчилан Сэргийлэх, Эмнэлгийн Үзлэгийн Хэлтэс нь 40-55 насны эрэгтэй, эмэгтэй хүмүүсийн тоо тэнцүү байсан 100 эрүүл донороос сийвэнгийн санг цуглуулсан. Донор бүрийн дээжийн тэнцүү хэмжээг хольж, үүссэн санг аликвотоор хувааж, -80°C-д хадгалсан. Сийвэнгийн хольцыг чанарын хяналт, өгөгдлийг стандартчилах лавлах материал болгон ашигласан.
Лавлах ийлдэс болон туршилтын дээжийг гэсгээж, метаболитуудыг хосолсон хандлах аргаар (MTBE/метанол/ус) гаргаж авсан 56. Товчхондоо, 50 мкл ийлдсийг 225 мкл мөстэй хүйтэн метанол болон 750 мкл мөстэй хүйтэн метил терт-бутил эфир (MTBE)-тэй хольсон. Холимгийг хутгаад мөсөн дээр 1 цаг инкубацалсан. Дараа нь дээжийг хольж, Кембрижийн изотопын лабораториос худалдаж авсан дотоод стандарт (13C-лактат, 13C3-пируват, 13C-метионин, 13C6-изолейцин) агуулсан 188 мкл MS зэрэглэлийн устай холино. Дараа нь хольцыг 4°C-д 15,000 × g-д 10 минутын турш центрифугээр ялгаж, доод фазыг эерэг ба сөрөг горимд LC-MS шинжилгээнд зориулж хоёр хоолой (тус бүр 125 мкл) руу шилжүүлсэн. Эцэст нь дээжийг өндөр хурдтай вакуум баяжуулагчид хуурай болтол нь ууршуулсан.
Хатаасан метаболитуудыг 120 мкл 80% ацетонитрилд дахин найруулж, 5 минутын турш хутгаж, 4°C-д 15,000 × g-д 10 минутын турш центрифугээр хийсэн. Метаболомикийн судалгаанд зориулж хэт давхаргыг микро оруулгатай хув шилэн саванд хийсэн. Хэт өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографийн өндөр нарийвчлалтай масс спектрометр (UPLC-HRMS) платформ дээр зорилтот бус метаболомик шинжилгээ хийсэн. Метаболитуудыг Dionex Ultimate 3000 UPLC систем болон ACQUITY BEH Амид багана (2.1 × 100 мм, 1.7 μм, Уотерс) ашиглан ялгасан. Эерэг ионы горимд хөдөлгөөнт фазууд нь 95% (A) ба 50% ацетонитрил (B) байсан бөгөөд тус бүр нь 10 ммоль/л аммонийн ацетат ба 0.1% шоргоолжны хүчил агуулсан байв. Сөрөг горимд А ба В хөдөлгөөнт фазууд нь тус тус 95% ба 50% ацетонитрил агуулсан бөгөөд хоёр фаз хоёулаа 10 ммоль/л аммонийн ацетат агуулсан, рН = 9. Градиентийн хөтөлбөр дараах байдалтай байв: 0–0.5 мин, 2% B; 0.5–12 мин, 2–50% B; 12–14 мин, 50–98% B; 14–16 мин, 98% B; 16–16.1 мин, 98 –2% B; 16.1–20 мин, 2% B. Авто дээж авагчид баганыг 40°C, дээжийг 10°C температурт байлгасан. Урсгалын хурд 0.3 мл/мин, тарилгын хэмжээ 3 мкл байв. Цахилгаан шүршигч ионжуулалтын (ESI) эх үүсвэртэй Q-Exactive Orbitrap масс спектрометр (Thermo Fisher Scientific)-ийг бүрэн сканнердах горимд ажиллуулж, ddMS2 хяналтын горимтой хослуулан их хэмжээний өгөгдөл цуглуулсан. MS параметрүүдийг дараах байдлаар тохируулсан: шүрших хүчдэл +3.8 кВ/- 3.2 кВ, капилляр температур 320°C, хамгаалалтын хий 40 арб, туслах хий 10 арб, датчик халаагчийн температур 350°C, сканнердах хүрээ 70–1050 м/цаг, нягтрал 70 000. Өгөгдлийг Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) ашиглан цуглуулсан.
Өгөгдлийн чанарыг үнэлэхийн тулд дээж бүрээс 10 мкл дээд давхаргын аликвотыг авч нэгтгэсэн чанарын хяналтын (QC) дээжийг гарган авсан. UPLC-MS системийн тогтвортой байдлыг үнэлэхийн тулд аналитик дарааллын эхэнд зургаан чанарын хяналтын дээжийн тарилгыг шинжилсэн. Дараа нь чанарын хяналтын дээжийг багцад үе үе оруулдаг. Энэхүү судалгаанд хамрагдсан сийвэнгийн дээжийн бүх 11 багцыг LC-MS аргаар шинжилсэн. 100 эрүүл донороос авсан сийвэнгийн сангийн хольцын аликвотыг тус тусын багцуудад лавлагаа материал болгон ашигласан бөгөөд олборлолтын үйл явцыг хянаж, багц хоорондын нөлөөллийг тохируулсан. Нээлтийн когорт, дотоод баталгаажуулалтын когорт, гадаад баталгаажуулалтын когортын зорилтот бус метаболомик шинжилгээг Сун Ят-сений Их Сургуулийн Метаболомикийн төвд хийсэн. Гуандунгийн Технологийн Их Сургуулийн Шинжилгээ, Туршилтын Төвийн гадаад лаборатори нь ангилагчийн загварын гүйцэтгэлийг шалгахын тулд гадаад когортоос 40 дээжийг шинжилсэн.
Олборлож, сэргээсний дараа сийвэнгийн метаболитын үнэмлэхүй тоон үзүүлэлтийг олон урвалын хяналтын (MRM) горимд электрошүршигч ионжуулалтын (ESI) эх үүсвэртэй хэт өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографи-тандем масс спектрометр (Agilent 6495 гурвалсан квадрупол) ашиглан хэмжсэн. Метаболитыг ялгахад ACQUITY BEH Амидын багана (2.1 × 100 мм, 1.7 μм, Уотерс) ашигласан. Хөдөлгөөнт фаз нь 90% (A) ба 5% ацетонитрил (B)-ийг 10 ммоль/л аммонийн ацетат ба 0.1% аммиакийн уусмалаар бүрдүүлсэн. Градиентийн хөтөлбөр нь дараах байдалтай байв: 0–1.5 мин, 0% B; 1.5–6.5 мин, 0–15% B; 6.5–8 мин, 15% B; 8–8.5 мин, 15%–0% B; 8.5–11.5 мин, 0%B. Авто дээж авагчид баганыг 40 °C, дээжийг 10 °C-д хадгалсан. Урсгалын хурд 0.3 мл/мин, тарилгын хэмжээ 1 мкл байв. MS параметрүүдийг дараах байдлаар тохируулсан: капилляр хүчдэл ±3.5 кВ, мананцар үүсгэгчийн даралт 35 psi, бүрхүүлийн хийн урсгал 12 л/мин, бүрхүүлийн хийн температур 350 °C, хатаах хийн температур 250 °C, хатаах хийн урсгал 14 л/мин. Триптофан, пируват, лактат, гипоксантин ба ксантины MRM хувиргалтууд тус тус 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 болон 151.0–107.9 байв. Өгөгдлийг Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) ашиглан цуглуулсан. Сийвэнгийн дээжийн хувьд триптофан, пируват, лактат, гипоксантин, ксантиныг стандарт хольцын уусмалын тохируулгын муруй ашиглан тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон. Эсийн дээжийн хувьд триптофаны агууламжийг дотоод стандарт болон эсийн уургийн масстай хэвийн болгосон.
Оргил гарган авах (м/з ба хадгалах хугацаа (RT))-ийг Compound Discovery 3.1 болон TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) ашиглан гүйцэтгэсэн. Багцуудын хоорондох боломжит ялгааг арилгахын тулд туршилтын дээжийн онцлог оргил бүрийг ижил багцаас авсан лавлах материалын онцлог оргилд хувааж харьцангуй элбэгшлийг гарган авсан. Стандартчилал хийхээс өмнө болон дараа дотоод стандартуудын харьцангуй стандарт хазайлтыг Нэмэлт Хүснэгт 6-д үзүүлэв. Хоёр бүлгийн хоорондох ялгааг хуурамч нээлтийн түвшин (FDR<0.05, Wilcoxon-ийн гарын үсэгтэй зэрэглэлийн тест) болон нугалалтын өөрчлөлт (>1.2 эсвэл <0.83)-аар тодорхойлсон. Гарган авсан шинж чанаруудын түүхий MS өгөгдөл болон лавлах ийлдэсээр залруулсан MS өгөгдлийг Нэмэлт Мэдээлэл 1 болон Нэмэлт Мэдээлэл 2-т тус тус харуулав. Оргил аннотацийг тодорхойлсон метаболит, таамагласан тайлбартай нэгдлүүд, таамагласан тодорхойлолттой нэгдлүүдийн ангилал, үл мэдэгдэх нэгдлүүд 22 зэрэг тодорхойлсон тодорхойлолтын дөрвөн түвшинд үндэслэн гүйцэтгэсэн. Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) дахь мэдээллийн сангийн хайлтууд дээр үндэслэн баталгаажсан стандартад нийцсэн MS/MS эсвэл mzCloud (оноо > 85) эсвэл Chemspider дахь яг тохирсон тэмдэглэгээтэй биологийн нэгдлүүдийг эцэст нь дифференциал метаболомын завсрын бүтээгдэхүүн болгон сонгосон. Онцлог шинж чанар бүрийн оргил тэмдэглэгээг Нэмэлт Мэдээлэл 3-т оруулсан болно. MetaboAnalyst 5.0-ийг нийлбэрээр хэвийн болгосон метаболитын элбэгшлийн нэг хувьсагчтай шинжилгээнд ашигласан. MetaboAnalyst 5.0 нь мөн мэдэгдэхүйц ялгаатай метаболитууд дээр үндэслэн KEGG замын баяжуулалтын шинжилгээг үнэлсэн. Үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээ (PCA) болон хэсэгчилсэн хамгийн бага квадратын ялгаварлан гадуурхалтын шинжилгээ (PLS-DA)-ийг ropls програм хангамжийн багц (v.1.26.4) ашиглан стекийн хэвийн болгох болон автомат масштабтайгаар шинжилсэн. Зангилааны хорт хавдрыг урьдчилан таамаглах оновчтой метаболитын биомаркерын загварыг хамгийн бага үнэмлэхүй агшилт болон сонголтын оператор (LASSO, R багц v.4.1-3) бүхий хоёртын логистик регресс ашиглан үүсгэсэн. Илрүүлэлт ба баталгаажуулалтын багц дахь ялгаварлан гадуурхах загварын гүйцэтгэлийг pROC багцын дагуу ROC шинжилгээнд үндэслэн AUC-ийг тооцоолсноор тодорхойлсон (v.1.18.0.). Хамгийн оновчтой магадлалын хязгаарыг загварын хамгийн их Юдений индекс (мэдрэг чанар + өвөрмөц чанар – 1) дээр үндэслэн олж авсан. Босго хэмжээнээс бага эсвэл их утгатай дээжийг тус тус хоргүй зангилаа, уушгины аденокарцинома гэж таамаглах болно.
A549 эсүүдийг (#CCL-185, Америкийн төрлийн өсгөврийн цуглуулга) 10% FBS агуулсан F-12K орчинд ургуулсан. SLC7A5-ийг чиглүүлсэн богино үстэй РНХ (shRNA) дараалал болон чиглүүлээгүй хяналтын (NC)-ийг лентивирусын вектор pLKO.1-puro-д оруулсан. shSLC7A5-ийн антисенс дараалал нь дараах байдалтай байна: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5-ийн эсрэгбие (#5347) болон тубулин (#2148)-ийг Cell Signaling Technology-ээс худалдаж авсан. SLC7A5 болон тубулины эсрэгбиеийг Western blot шинжилгээнд 1:1000 шингэрүүлэлтээр ашигласан.
Seahorse XF гликолитик стресс тест нь эсийн гаднах хүчилжилт (ECAR) түвшинг хэмждэг. Шинжилгээнд ECAR-аар хэмжсэн эсийн гликолитик чадварыг шалгахын тулд глюкоз, олигомицин А, 2-DG-г дараалан өгсөн.
А549 эсийг онилох бус хяналтын (NC) болон shSLC7A5 (Sh1, Sh2)-ээр трансфекц хийсэн бөгөөд 10 см диаметртэй аяганд шөнөжин байрлуулсан. Эсийн метаболитуудыг 1 мл мөстэй хүйтэн 80% усан метанолоор гаргаж авсан. Метанолын уусмал дахь эсүүдийг хусаж, шинэ хуруу шилэнд цуглуулж, 15,000 × g-д 4°C-т 15 минутын турш центрифугээр халаана. 800 µl дээд давхаргыг цуглуулж, өндөр хурдтай вакуум баяжуулагч ашиглан хатаана. Дараа нь хатаасан метаболит үрэлийг дээр дурдсанчлан LC-MS/MS ашиглан триптофаны түвшинд шинжилсэн. А549 эсүүд дэх (NC болон shSLC7A5) эсийн NAD(H) түвшинг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу тоон NAD+/NADH колориметрийн хэрэгсэл (#K337, BioVision) ашиглан хэмжсэн. Метаболитын хэмжээг хэвийн болгохын тулд дээж бүрийн уургийн түвшинг хэмжсэн.
Түүврийн хэмжээг урьдчилан тодорхойлоход статистикийн арга хэрэглээгүй. Биомаркер нээхэд чиглэсэн өмнөх метаболомикийн судалгааг15,18 хэмжээг тодорхойлох жишиг гэж үзсэн бөгөөд эдгээр тайлангуудтай харьцуулахад бидний дээж хангалттай байсан. Судалгааны когортоос ямар ч дээжийг хасаагүй. Сийвэнгийн дээжийг зорилтот бус метаболомикийн судалгаанд зориулж нээлтийн бүлэг (306 тохиолдол, 74.6%) болон дотоод баталгаажуулалтын бүлэгт (104 тохиолдол, 25.4%) санамсаргүй байдлаар хуваарилсан. Мөн бид зорилтот метаболомикийн судалгаанд зориулж нээлтийн багцаас бүлэг бүрээс 70 тохиолдлыг санамсаргүй байдлаар сонгосон. Судлаачид LC-MS өгөгдөл цуглуулах, шинжлэх явцад бүлгийн хуваарилалтыг хийх боломжгүй байсан. Метаболомикийн өгөгдөл болон эсийн туршилтын статистик шинжилгээг тус тусын Үр дүн, Зургийн домог, Арга зүйн хэсгүүдэд тайлбарласан болно. Эсийн триптофан, NADT болон гликолитик идэвхжилийн тоон үзүүлэлтийг гурван удаа бие даан гүйцэтгэсэн бөгөөд ижил үр дүнтэй байсан.
Судалгааны дизайны талаар дэлгэрэнгүй мэдээллийг энэ нийтлэлтэй холбоотой Байгалийн Портфолиогийн тайлангийн товч агуулгаас үзнэ үү.
Олборлосон шинж чанаруудын түүхий MS өгөгдөл болон лавлагаа сийвэнгийн хэвийн болгосон MS өгөгдлийг тус тус Нэмэлт Мэдээлэл 1 болон Нэмэлт Мэдээлэл 2-т харуулав. Ялгаатай шинж чанаруудын оргил тэмдэглэгээг Нэмэлт Мэдээлэл 3-т үзүүлэв. LUAD TCGA өгөгдлийн санг https://portal.gdc.cancer.gov/ хаягаас татаж авах боломжтой. График зурах оролтын өгөгдлийг эх сурвалжийн өгөгдөлд оруулсан болно. Эх сурвалжийн өгөгдлийг энэ нийтлэлд оруулсан болно.
Үндэсний уушгины скрининг судалгааны бүлэг гэх мэт. Бага тунгаар компьютер томографийн шинжилгээгээр уушгины хорт хавдрын нас баралтыг бууруулах нь. Хойд Англи. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Крамер, Б.С., Берг, К.Д., Аберле, Д.Р. болон Пропэт, П.К. Бага тунтай мушгиа хэлбэрийн компьютер томографи ашиглан уушгины хорт хавдрын скрининг хийх нь: Үндэсний уушгины скрининг судалгааны (NLST) үр дүн. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
Де Конинг, ХЖ, нар. Санамсаргүй туршилтаар эзэлхүүнтэй компьютер томографийн шинжилгээгээр уушгины хорт хавдрын нас баралтыг бууруулах. Хойд Англи. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Нийтэлсэн цаг: 2023 оны 9-р сарын 18