CRISPR) нь гурав дахь үеийн геном засварлах арга юм: CRISPR дэлхийг хувьсгал хийсэн

Бөөгнөрсөн тогтмол завсарлагатай богино палиндромик давталтууд (CRISPR) нь өндөр бүтээмжтэй үр дүнгээрээ дэлхийд хувьсгал хийсэн гурав дахь үеийн геном засварлах арга юм. Үүнийг янз бүрийн биологийн өвчин, халдварыг эмчлэхэд ашиглаж ирсэн. Төрөл бүрийн бактери болон бусад прокариотууд (жишээлбэл, архей) нь фагуудаас хамгаалах CRISPR/Cas9 системтэй байдаг. CRISPR/Cas9 дээр суурилсан стратегиуд нь өөрчлөгдөж болзошгүй эсэргүүцлийн ген, транскрипц, эпигенетикийн зохицуулалтыг чиглүүлснээр гурвалсан сөрөг хөхний хорт хавдрын (TNBC) өсөлт, явцыг дарангуйлж чадна гэж мэдээлсэн. Эдгээр эмчилгээний арга хэмжээ нь TNBC-д ажиглагдсан эмийн эсэргүүцэл зэрэг хүнд хэцүү асуудлуудыг шийдвэрлэхэд тусалж магадгүй юм. Одоогийн байдлаар CRISPR/Cas9-ийг зорилтот эсүүдэд хүргэхийн тулд физик (микро тарилга, электропораци ба гидродинамик горим), вирус (аденотой холбоотой вирус ба лентивирус) болон вирусгүй (липосом ба липидийн нано хэсгүүд) гэх мэт янз бүрийн аргуудыг ашиглаж байна. )- хэсгүүд). TNBC-ийн молекулын шалтгааныг судлахын тулд янз бүрийн загваруудыг боловсруулсан боловч in vivo геномын засварлах хэрэгслийг хүргэх мэдрэмтгий, зорилтот аргууд дутмаг байгаа нь тэдгээрийн клиник хэрэглээг хязгаарладаг. Товчхондоо, энэхүү тоймд одоо байгаа нотолгоонд үндэслэн TNBC-ийн CRISPR/Cas9 эмчилгээний явц, бэрхшээл, хязгаарлалт, хэтийн төлөвийг цогцоор нь авч үзсэн болно. Мөн бид хиймэл оюун ухаан болон машин сургалтын хослол нь TNBC-ийн эмчилгээнд CRISPR/Cas9 стратегийг хэрхэн сайжруулж болохыг онцолсон.
Хорт хавдар нь хяналтгүй эсийн хуваагдал, эсийн мөчлөгийн хяналтын цэгүүдийн тасалдал, хавдрын дарангуйлагч генийн (TSGs) мутаци зэргээр тодорхойлогддог (Matthews et al., 2022). Хорт хавдрын янз бүрийн төрлүүдийн дунд хөхний хорт хавдар нь эмэгтэйчүүдэд хамгийн түгээмэл тохиолддог хорт хавдрын төрөл бөгөөд дэлхий даяар нас баралтын түвшин өндөр байдаг (Waks and Winer, 2019). Хөхний хорт хавдар нь гистологи, биологийн шинж чанар, клиник илрэл, зан үйл, эмчилгээнд үзүүлэх хариу урвал зэрэг олон янзын шинж чанартай олон янзын өвчин юм (Weigelt et al., 2010). Хөхний хорт хавдрын ангилал нь хөхний хорт хавдрын оношлогоо, хавдрын тавилантай холбоотой нарийн ойлголтыг өгдөг. Нийтлэг биомаркер болон клиник эмгэг судлалын шинж чанарыг ашиглах нь хөхний хорт хавдрын ангиллын гол шалгуур байсаар ирсэн (Tsang and Tse, 2019). Хөхний хорт хавдрын тавилан, эмчилгээний хариу урвал нь эстрогений рецептор (ER), прогестерон рецептор (PR), хүний ​​эпидермисийн өсөлтийн хүчин зүйлийн рецептор 2 (HER2/neu), гистологийн зэрэг, хавдрын төрөл, зэрэг зэрэг зэрэг зэрэг олон хүчин зүйлээс хамаардаг. хэмжээ болон тунгалгийн булчирхайн үсэрхийлэл (Al-Tubaiti, 2020). Хөхний хорт хавдрын таван дотоод молекулын дэд хэв шинжийг тодорхойлсон бөгөөд үүнд люминал А, люминал В, HER2-оор баяжуулсан, суурь төст, клаудин бага (Prat et al., 2015). TNBC нь бүх ER, PR, HER2-ийг илэрхийлдэггүй хорт хавдрын молекулын дэд хэв шинж юм (Yin et al., 2020). Эдгээр эмгэг судлалын шинж чанарууд нь TNBC-тэй холбоотой бөгөөд энэ нь түүний хурдан явцтай, бусад төрлийн хөхний хорт хавдраас илүү түрэмгий шинж чанартай болохыг баталж байна (Feng et al., 2018). Нэмж дурдахад, Перу болон бусад (2000) нь хөхний хорт хавдрыг дахин ангилж, хөхний хорт хавдрын таван дотоод дэд хэв шинжийг тодорхойлохын тулд микроаррай технологийг ашигласан (Cadenas, 2012). Суурь төст хөхний хорт хавдар нь гурвалсан сөрөг фенотиптэй бөгөөд хурдан явцтай холбоотой хөхний хорт хавдрын дэд хэв шинж юм. Бүх суурь хэлбэрийн хөхний хорт хавдрыг ихэвчлэн TNBC гэж буруу оношлодог боловч зөвхөн 77% нь TNBC байдаг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй; Үүний эсрэгээр, TNBC-ийн 71-91% нь суурь хэлбэрийн хөхний хорт хавдартай бөгөөд энэ хоёр төрлийн хөхний хорт хавдар давхцаж, өөр өөр ангиллыг илэрхийлдэг болохыг харуулж байна (Wang D.-Y. et al., 2019). Энэ нь тавилангаа тодруулах, одоогийн болон ирээдүйн эмчилгээнд үзүүлэх болзошгүй хариу урвалыг тодорхойлохын тулд TNBC-ийн олон янз байдлыг тодорхойлох шаардлагатай болгож байна. Нэмж дурдахад, TNBC нь хөхний хорт хавдрын бүх тохиолдлын 15-20%-ийг эзэлдэг бөгөөд 50-аас доош насны эмэгтэйчүүдэд илүү түгээмэл байдаг. BRCA1 эсвэл BRCA2 мутаци нь TNBC тохиолдлын ойролцоогоор 20%-д бүртгэгдсэн байдаг (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Судалгаагаар TNBC нь судасны эндотелийн өсөлтийн хүчин зүйлс, хавдартай холбоотой макрофагууд (TAMs), хавдарт нэвчдэг лимфоцитууд (TILs) болон хавдрын өсөлт, шилжилт хөдөлгөөнд оролцдог бусад молекулуудыг багтаасан өвөрмөц дархлааны бичил орчинтой болохыг харуулсан. Тиймээс TNBC-ийн бичил орчныг ойлгох нь түүний тавилан, эмчилгээнд чухал ач холбогдолтой юм (Fan and He, 2022).
TNBC-ийн тавилан, үр дүнтэй эмчилгээг баталгаажуулахын тулд голчлон ER, PR болон HER2-ийг илрүүлэх иммуногистохими (IHC), мөн хөхний хавдрын илрэлийг илрүүлэх маммографи дээр үндэслэн үнэн зөв оношлох нь чухал юм. Гэсэн хэдий ч маммографи нь үхжил, фиброз зэрэг хавдрын доторх шинж чанарыг хангалттай дүрсэлж чадахгүй (Deepak Singh et al., 2021). Таамаглал, оношлогоо муу байгаа нь эмч нарт зөв эм бичиж өгөхөд саад болдог тул (Chaudhary, 2020) TNBC-тэй өвчтөнүүдийн эмчилгээг сайжруулахын тулд янз бүрийн стратегиудыг ашигладаг. Одоогийн байдлаар TNBC-тэй өвчтөнүүдэд доксорубицин, циклофосфамид гэсэн хоёр эмийг хэрэглэж байгаа бөгөөд сайн үр дүн үзүүлсэн. Үүнээс гадна карбоплатин, цисплатин зэрэг бусад цагаан алтны эмийг хэрэглэдэг (Sikov et al., 2015). Үүнээс гадна, Olaparib, Velaparib, PF-01367338 зэрэг PARP дарангуйлагчдыг TNBC-ийн эмчилгээнд химийн эмчилгээний боломжит эм болгон ашиглаж ирсэн (Ishino et al., 2018). Wnt/b-Catenin, NOTCH, Hedgehog дохиоллын замууд нь TNBC-ийн үүсэл, явцтай холбоотой гэж мэдээлсэн тул эдгээр замд эмийг чиглүүлэх нь чухал стратеги байж болох юм (Aysola et al., 2013). Мэс засал, туяа эмчилгээ, хими эмчилгээ нь өнөөдөр TNBC-ийн эмчилгээний гол тулгуур хэвээр байгаа ч зорилтот эмчилгээ, дархлаа эмчилгээ, Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12 зэрэг CRISPR-тэй холбоотой генийн засварлах янз бүрийн хэрэгслүүд, үндсэн засвар, CRISPR/Cas9-тэй чиглэсэн генийн эмчилгээ зэрэг шинэ эмчилгээг боловсруулахад мэдэгдэхүйц ахиц дэвшил гарсан. Энд бид TNBC-ийн эмчилгээнд ашигладаг CRISPR-тэй холбоотой янз бүрийн генийн засварлах хэрэгслүүдэд анхаарлаа хандуулах болно. Тэдгээрийн дотроос CRISPR/Cas9 нь өргөн хүрээний анхаарал татсан.
Cas9n буюу Cas9 никаза нь CRISPR/Cas9 геномын засварлах системээс гаргаж авсан Cas9 уургийн генетикийн хувьд өөрчлөгдсөн хувилбар юм (Gupta et al., 2019). Анхны хэлбэрээрээ Cas9 уураг нь хоёр нуклеазын домэйн агуулдаг: RuvC ба HNH бөгөөд тэдгээрийн гол үүрэг нь ДНХ-ийн хоёр хэлхээг задлах явдал юм. Гэсэн хэдий ч Cas9n-д нуклеазын домэйнуудын нэг болох HNH нь генетикийн хувьд мутацид орж, идэвхгүй болдог. Тиймээс Cas9n-ийн HNH домэйн нь үйл ажиллагаагүй хэвээр байна. Зөвхөн RuvC домэйн идэвхтэй хэвээр байгаа нь Cas9n-д ганц ДНХ-ийн хэлхээнд таслах эсвэл завсарлага үүсгэх боломжийг олгодог (Trevino and Zhang, 2014). Cas9-тай харьцуулахад Cas9n нь зорилтот бус нөлөөллийг үр дүнтэй бууруулж, эсийн нөхөн сэргээх механизмыг нарийвчлалтай сайжруулж чадна. Cas9n-ийг давхар хэлхээтэй ДНХ-ийн тодорхой байршилд завсарлага үүсгэх гэх мэт янз бүрийн асуудлыг шийдвэрлэхэд ашиглаж болно. Үүний тулд хоёр Cas9n молекулыг нэгтгэж, хамтад нь ашигласан (Yee, 2016). Холимог шугаман киназа 3 (MLK3) нь TNBC үсэрхийллийн үед гол зохицуулагч болдог митогенээр идэвхжүүлсэн уургийн киназа юм (Cronan et al., 2012).
MLK3 нь TNBC үсэрхийлэлд хүргэдэг олон дохиоллын замыг идэвхжүүлж чаддаг. Жишээлбэл, c-Jun N-терминал киназа (JNK) зам нь эсийн хөдөлгөөн болон эсийн гаднах матрицын задралыг зохицуулдаг бол MLK3 нь JNK замыг идэвхжүүлж, улмаар эсийн хөдөлгөөнийг сайжруулж, инвазив шинж чанарыг өгдөг (Rattanasinchai болон Gallo, 2016). MLK3 нь мөн EMT-г зохицуулдаг. Үүний тулд Snail, Slug болон Twist зэрэг доош чиглэсэн транскрипцийн хүчин зүйлсийг идэвхжүүлдэг. Эдгээр хүчин зүйлүүд нь хучуур эдийн маркеруудын илэрхийлэлийг дарангуйлж, мезенхимийн маркеруудын илэрхийлэлийг дэмжиж, үсэрхийллийн фенотипийг олж авахад хүргэдэг (Casalino et al., 2023). MLK3 нь ECM-ийн өөрчлөлт болон ECM-ийг задалдаг матриц металлопротеиназа (MMPs) зэрэг протеазуудыг идэвхжүүлэхэд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг ажигласан. Энэ нь хавдрын эсийн нэвтрэлт болон алслагдсан хэсгүүдэд тархалтыг хөнгөвчилдөг (Katari et al., 2019). Тиймээс өмнөх судалгаагаар MLK3 нь TNBC-д чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулсан. Раттанасинчай болон Галло нар TNBC загваруудыг ашиглан MLK3-ийн үүргийг судалж, энэ нь тодорхой дохиоллын замаар хорт хавдрын хөгжлийг дэмждэг болохыг тогтоожээ. Тэд MLK3-ийг засварлахын тулд CRISPR/Cas9n-ийг ашиглаж, TNBC-ийн үсэрхийлэл мэдэгдэхүйц буурсан болохыг ажигласан (Раттанасинчай болон Галло, 2016).
dCas9 буюу ихэвчлэн идэвхгүй Cas9 гэж нэрлэгддэг нь Cas9 уургийн өөрчлөгдсөн дериватив хэлбэр юм. Идэвхтэй Cas9-ээс ялгаатай нь dCas9 нь эндонуклеазын идэвхжилгүй тул ДНХ-ийн давхар судалтай завсарлагааг өдөөх чадваргүй болдог. Тиймээс dCas9-ийг ДНХ-ийн дараалалд ямар ч өөрчлөлт, өөрчлөлт оруулахгүйгээр геномын тодорхой хэсгүүдийг нарийн чиглүүлэхэд ашиглаж болно (Wang et al., 2016). dCas9-д эндонуклеазын хоёр уураг болох RuvC ба HNH нь чухал амин хүчлийн үлдэгдлийг дарангуйлснаар идэвхгүйждэг. (Richter et al., 2016). ДНХ-ийн задралын идэвхжилгүй хэдий ч dCas9 нь генетикийн судалгаа, биотехнологид хэд хэдэн чухал үүрэг гүйцэтгэдэг. Жишээлбэл, энэ нь геномын тодорхой хэсгүүдийг дүрслэх боломжийг олгодог, транскрипцийн зохицуулалтыг хөнгөвчилж, эпигенетикийн өөрчлөлтийг дэмждэг (Brocken et al., 2018).
Транскрипцийн хүчин зүйл ZEB1 (цайрын хурууны E-хайрцаг холбогч гомеобокс 1) нь үр хөврөлийн хөгжил, эд эсийн нөхөн сэргэлт, хорт хавдрын явцын үед явагддаг эсийн процесс болох хучуур эдийн мезенхимийн шилжилтийг (EMT) зуучлахад тодорхой бөгөөд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг. Энэ нь хучуур эдийн эсийг мезенхимийн эс болгон хувиргах үйл явцыг хамардаг бөгөөд үүний үр дүнд эсийн морфологи, хөдөлгөөн, инвазив байдал гэх мэт өөрчлөлтүүд гардаг (Wu et al., 2020). ZEB1 нь TNBC-д хучуур эдийн эсийн эсийн наалдац ба туйлшралыг хадгалах үүрэгтэй E-кадгерин ба Окклюдин зэрэг олон хучуур эдийн маркеруудыг дарангуйлдаг (Moreno-Bueno et al., 2008). Үүнээс гадна, ZEB1 нь N-кадгерин, виментин ба фибронектин зэрэг тодорхой маркеруудыг идэвхжүүлдэг (Konradi et al., 2014) мөн Rho GTPaza болон матриц металлопротеиназа (MMPs) зэрэг цитоскелетийн өөрчлөлтөд оролцдог генүүдийг зохицуулдаг (Huang). et al., 2014). 2022), үүнээс гадна энэ нь өсөлтийн хүчин зүйл-β (TGF-β), Wnt дохиолол гэх мэт янз бүрийн дохиоллын замд нөлөөлж, улмаар TNBC-д хавдрын нэвчилт болон үсэрхийллийг дэмждэг (Chen et al., 2016). Олон тооны судалгаа, шинжлэх ухааны нотолгоо нь ZEB1 нь TNBC-г илрүүлэх, эмчилгээний оролцоонд үнэ цэнэтэй бодис болох асар их боломжтой болохыг харуулж байна. Саяхны нэгэн судалгаанд Waryah et al. TNBC загварыг ашиглаж, dCas9-ээр ZEB1-ийг бүрэн дарангуйлсан. Тиймээс тэд in vivo нөхцөлд маш өндөр өвөрмөц чанар, бараг бүрэн дарангуйллыг ажигласан (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 нь CRISPR/Cpf1 гэж нэрлэгддэг ген засварлах хэрэгсэл юм. Энэ нь CRISPR/Cas системээс гаралтай бөгөөд Cas12 гэдэг нэр томьёо нь Cas9-тэй бүрэн төстэй CRISPR-тэй холбоотой уураг 12-ыг хэлдэг (Bharathkumar et al., 2022). Ганц ялгаа нь Cas12 уураг агуулдагт оршино. Cas9-тэй харьцуулахад Cas12 нь ген засварлах явцад наалдамхай үзүүр үүсгэх зэрэг өвөрмөц функцтэй байдаг бол Cas9 нь мохоо үзүүр үүсгэдэг (Wang et al., 2021). Cas12-ийн энэ шинж чанар нь түүний ДНХ-ийн удирдлагын өвөрмөц технологид хувь нэмэр оруулдаг. Бай ДНХ-ийг нарийн таньж, таслах чадвартай уураг тул энэ нь ер бусын олон талт шинж чанартай тул ген засварлах зэрэг олон төрлийн хэрэглээнд үр дүнтэй хэрэгсэл болдог (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019).
CRISPR-ийн бусад хувилбаруудтай адил CRISPR/Cas12 нь TNBC-д генийг унагаах эсвэл идэвхжүүлэх чадвартай бөгөөд түүний эмгэг жам эсвэл эмчилгээнд үзүүлэх хариу урвалд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг генүүдийг чиглүүлдэг (Yang and Zhang, 2023). Энэ процессыг гүйцэтгэхийн тулд Cas12-г зорилтот ген рүү чиглүүлдэг чиглүүлэгч РНХ (gRNA)-г боловсруулсан. Cas12 нь зорилтот гентэйгээ холбогдсны дараа ДНХ-д давхар судалтай завсарлага оруулж, ДНХ-ийн нөхөн сэргээх механизмыг идэвхжүүлдэг. Засварлах явцад буруу нуклеотидууд орж, генийн мутаци, үйл ажиллагааны алдагдалд хүргэж болзошгүй (Zhang et al., 2021a). Үүнээс гадна, генийг идэвхжүүлэхэд Cas12 ферментийн сайжруулсан хувилбарыг (dCas12 гэж нэрлэдэг) ашигласан. Үүнийг транскрипцийн идэвхжүүлэгчтэй нэгтгэснээр тодорхой генийг өдөөж, улмаар тэдгээрийг идэвхжүүлэх боломжтой. Энэхүү технологи нь хавдрын дарангуйлагч генийг идэвхжүүлэхийг дэмжих асар их боломжтой (Sultan et al., 2022).
Прайм засварлах нь шинээр боловсруулсан бөгөөд маш дээд зэргийн геном засварлах технологи юм. Энэ нь организмын ДНХ-г маш нарийн өөрчлөх чадвартай (Chen and Liu, 2023). Прайм засварлах нь өөрчлөгдсөн CRISPR/Cas9 фермент болон урвуу транскриптаза гэсэн хоёр үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийг нэгтгэснээр хийгддэг. CRISPR/Cas9 ферментийн үүрэг нь геномын тодорхой хэсгүүдийг сонгон чиглүүлэх явдал бөгөөд урвуу транскриптаза нь зорилтот байршил дахь ДНХ-г бүрэн өөрчлөхөд тусалдаг (Hassan et al., 2021). Праймер засварлах механизмын эхний алхам нь праймер засварлах гарын авлага РНХ (pegRNA) үүсгэх явдал юм (Standage-Beier et al., 2021). Энэ нь зорилтот ДНХ-ийн хүссэн засварлах хэсэгт харгалзах зорилтот дараалал болон РНХ-ийн загварыг агуулдаг. Дараа нь pegRNA-г праймер засварлах нуклеаза (PE2)-тай хамт зорилтот эсүүдэд оруулдаг. PE2 нь Cas9 фермент, урвуу транскриптаза болон праймер засварлах адаптераас бүрдэх нэгдлийн уураг юм (Martín-Alonso et al., 2021). Эсийн дотор pegRNA болон PE2 цогцолборууд нь өөрчлөхийг хүссэн тодорхой ДНХ-г хайдаг. Cas9 фермент нь ДНХ-г тайрч, дан судалтай загвар үүсгэдэг (Чой нар, 2022). Урвуу транскриптаза нь энэ загварыг ашиглан ДНХ-г засварлахад бэлтгэдэг. ДНХ-г хуулахаас гадна РНХ-ийн загварыг засварлах зааврыг оруулсан болно. Эцэст нь шинээр үүсгэсэн ДНХ-ийн судалтай хэсгийг ДНХ-ийн завсарлагааг засах загвар болгон ашигладаг бөгөөд үүний үр дүнд хүссэн өөрчлөлтийг агуулсан өөрчлөгдсөн ДНХ-ийн дараалал үүсдэг (Очоа-Санчез нар, 2021). Праймер засварлах механизм нь генд өргөн тархсан мутацид хүргэж болзошгүй. Энэ нь цэгийн мутаци, оруулга, устгал, тэр ч байтугай генийн орлуулалтыг онилж чаддаг (Анзалон нар, 2019; Чен ба Лиу, 2023). Прайм засварлах нь өмнөх геном засварлах технологиудаас хэд хэдэн давуу талыг санал болгодог. Үүнд нарийвчлал нэмэгдэх, зорилтот бус нөлөөллийг бууруулах, ДНХ-ийн давхар судалтай завсарлагад найдахгүй ДНХ-г засварлах чадвар орно (Анзалон нар, 2020).
CRISPR/Cas9 технологийг анх плазмидын дамжуулалт болон фагийн халдвараас бактерийг хамгаалах зорилгоор боловсруулсан бөгөөд хожим нь геномыг засварлах үр дүнтэй РНХ дээр суурилсан ДНХ-г чиглүүлэх хэрэгсэл болгон дахин ашигласан (Жианг ба Дудна, 2017). Үүнээс гадна, CRISPR/Cas9 систем нь бактерийн болон архей геномын 50% ба 87%-д тус тус байдаг гэж мэдээлсэн (Ишино нар, 2018). CRISPR/Cas9 нь in vivo болон in vitro горимыг ашиглан аливаа хэвийн бус генетикийн дарааллыг устгах, оруулах, засах боломжтой хэрэгсэл юм (Сабит нар, 2021). Түүнчлэн, CRISPR/Cas9 нь сонирхсон зорилтот генүүдэд өвөрмөц байдгаараа дасан зохицох дархлааны системийн нэг хэсэг болох нь батлагдсан (Чен ба Жан, 2018).
CRISPR/Cas9 нь Cas9 болон ганц хөтөч РНХ (sgRNA)-аас бүрдэнэ. Cas9 нь олон уургийн бүрэлдэхүүн хэсгээс бүрдсэн эндонуклеаза юм. Үүнээс гадна, Cas9 нь таних (REC) болон нуклеаза (NUC) гэсэн хоёр дэлбээнээс бүрддэг тул өвөрмөц бүтэц, конформацийн шинж чанартай байдаг (Pacesa et al., 2022). REC дэлбээг цааш нь гурван бүсэд хуваадаг: REC1, REC2 болон гүүрний мушгиа (Cromwell et al., 2018). NUC нь RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH болон протоспейсерийн зэргэлдээх мотив (PAM) харилцан үйлчлэлийн домэйн гэсэн гурван дэлбээнээс бүрдэнэ (Зураг 1) (Song et al., 2016). sgRNA нь CRISPR РНХ (crRNA) болон транскодчилдог жижиг РНХ (intracer RNA) гэсэн хоёр бүрэлдэхүүн хэсгээс бүрдэнэ (Зураг 1). sgRNA нь Cas9 уургийг коннексинтэй холбож, идэвхтэй цогцолбор үүсгэдэг бөгөөд үүнийг эффектор цогцолбор гэж нэрлэдэг (Richter et al., 2012). crRNA нь зорилтот ДНХ-ийн дарааллыг танихад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг 18-20 нуклеотидын суурь хос юм. Үүнээс гадна, crRNA зорилтот ДНХ-тэй хослодог бөгөөд tracrRNA нь Cas9 нуклеаза нь зорилтот ДНХ-тэй холбогдох тулгуур болж үйлчилдэг (Manghwar et al., 2019). Нөгөөтэйгүүр, PAM дараалал нь 3 нуклеотидтай бөгөөд энэ нь эффектор цогцолборыг ДНХ-тэй холбохыг баталгаажуулж, тодорхойлж, зуучилдаг. Cas9 уургийн цогцолборын дэд нэгжүүд болох RuvC ба HNH нь каталитик идэвхжилтэй байдаг (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021). Cas9 дэд нэгжийн HNH нуклеаза домэйн нь crRNA-тай холбоотой ДНХ-ийн хэлхээг тасалдаг. RuvC нуклеазын домэйн нь бусад ДНХ-ийн хэлхээг тасалж, давхар хэлхээний завсарлага (DSB) үүсгэдэг бөгөөд үүний дараа хоёр өөр ДНХ-ийн завсарлагааны нөхөн сэргээх механизм идэвхждэг (Жианг ба Дудна, 2017) (Зураг 1).
Зураг 1. CRISPR/Cas9-ийн тойм (A). CRISPR/Cas9 системийн бүрэлдэхүүн хэсгүүд: (i). Cas9 эндонуклеаза нь зорилтот ДНХ-ийн дарааллыг таслах, (ii) crRNA болон tra-crRNA химерүүдийн нэгдлээс үүссэн дан хөтөч (sg) РНХ-г таслах үүрэгтэй. (хоёр). Cas9 нь Rec I, Rec II, NUC лоб (HNH ба Ruv C нь дэд бүрэлдэхүүн хэсгүүд) болон PAM харилцан үйлчлэлийн домэйн (C) зэрэг харгалзах функцтэй хэд хэдэн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг агуулдаг. CRISPR/Cas9 уургийн цогцолбор нь ДНХ-ийн дарааллыг нэмэлт бус болон нэмэлт хэлбэрт хуваадаг (D). CRISPR/Cas9 нь геномыг гурван үе шаттайгаар засварладаг: таних, таслах, засах. Зохион бүтээсэн sg-RNA нь Cas9-ийг чиглүүлж, нэмэлт бүрэлдэхүүн хэсэг crRNA-аар дамжуулан хүссэн дарааллыг танина. Cas9 нь PAM дарааллыг 5′-NGG-3′ дээр таньж, ДНХ-ийг хайлуулж, ДНХ-РНХ-ийн эрлийз үүсгэж, хуваагдлыг идэвхжүүлдэг. Cas9-ийн HNH домэйн нь нэмэлт хэлхээг, RuvC домэйн нь нэмэлт бус хэлхээг тасалдаг. CRISPR/Cas9 нь dsДНХ-г хоёр аргаар задалснаар засварладаг: гомолог бус төгсгөлийн холболт (NHEJ) болон гомолог чиглэсэн засвар (HDR). NHEJ нь гадны гомолог ДНХ байхгүй үед давхар хэлхээтэй ДНХ-г ферментийн процессоор дамжуулан засварладаг бөгөөд энэ нь санамсаргүй ДНХ-ийн дарааллыг оруулах эсвэл арилгах боломжтой алдаа гарах магадлалтай механизм юм. HDR нь маш өвөрмөц бөгөөд гомолог ДНХ-ийн загваруудыг шаарддаг.
CRISPR/Cas9-зуучлалтай засварлах замд гомолог бус төгсгөлийн нэгдэл (NHEJ) болон гомологи чиглэсэн засварлах (HDR) механизмууд багтдаг. NHEJ нь оруулах эсвэл устгах үйл явцыг хамардаг бөгөөд засварлах механизмын явцад ямар нэгэн хэв маяг шаарддаггүй тул алдаа гарах хандлагатай зам юм. Энэ нь стандарт уургуудыг үүсгэхийн тулд санамсаргүй нуклеотидуудыг ашигладаг (Abbasi et al., 2021). Энэхүү засварлах систем нь KU цогцолбор, хөндлөн нөхөгдөх уургийн цогцолбор 4-р төрөл (XRCC-4), ДНХ-ийн төгсгөлийн боловсруулалтын фермент, уургийн киназа ДНХ-PKcs зэрэг дөрвөн цогцолбороос бүрдэнэ (Abbasi et al., 2021). KU цогцолборын уураг нь Ku 70 ба Ku 80 гэсэн хоёр дэд нэгжтэй бөгөөд NHEJ механизмд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг, учир нь засварлах механизм нь хоёр дэд нэгж (Ku 70 ба Ku 80) нь зорилтот ДНХ-ийн мохоо эсвэл бараг мохоо үзүүрт холбогдсноор эхэлдэг (Abbasi et al., 2021) бөгөөд энэ нь гэмтлийн хэсэгт NHEJ-тэй холбоотой бусад хүчин зүйлсийг татах тулгуур болж үйлчилдэг (Yang et al., 2020). XRCC-4 ба ДНХ-ийн лигаза нь тус тус 334 ба 911 амин хүчлээс бүрддэг бөгөөд XRCC4-ДНХ-ийн лигаза IV цогцолбор нь ДНХ-ийн үзүүрүүдийн холболтыг идэвхжүүлдэг (Chatterjee et al., 2015). ДНХ-ийн төгсгөлийн боловсруулалтын фермент буюу полинуклеотид киназа 3′-фосфат нь ДНХ-ийн төгсгөлийн боловсруулалтын фермент юм. Энэ нь ДНХ-ийн 3′P бүлгийг зайлуулж, DSB-ийн засварлах явцад 5′OH бүлгийг фосфоржуулж чаддаг. Энэ нь мөн SSB засварлах замыг ашиглан дан судалтай завсарлага (SSB)-ийг засах ажлыг хамардаг (Chatterjee et al., 2015). Уураг киназа ДНХ-PKcs нь ДНХ-ээс хамааралтай уургийн киназа бөгөөд PIKKs (фосфатидилинозитол 3-киназатай холбоотой киназууд) болон мутацид орсон атакси телангиэктази (ATM) бүл, мөн ATM болон Rad3-тэй холбоотой ATR-үүдийн каталитик дэд нэгжээс бүрдэнэ. Уураг завсарлага (DSBs) болон дан судалтай завсарлага (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR нь илүү нарийвчлалтай бөгөөд тохиромжтой засварлах механизм юм, учир нь мэдээллийг гомолог ДНХ-ийн дуплексийн бүрэн бүтэн хэлбэрийг ашиглан хуулбарладаг боловч эгч хроматидууд шаардлагатай байдаг. Энэ нь хөхтөн амьтдын эсийн мөчлөгийн S/G2 үе шатанд тохиолддог. HDR нь голчлон мөөгөнцрийн төрөл зүйлд тохиолддог боловч NHEJ нь хөхтөн амьтдад чухал ач холбогдолтой (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Бүрэн засварлах механизмыг Зураг 1-т үзүүлэв.
TNBC нь генетикийн болон эпигенетикийн гажигаас үүдэлтэй тул CRISPR/Cas9 ашиглан хорт хавдрын геном/эпигеномик гажигийг засах нь эмчилгээний боломжийн арга байж болох юм (Chen et al., 2019). Үүнээс гадна, эсийн өвөрмөц транскрипцийн зохицуулалтад оролцдог зарим транскрипцийн хүчин зүйлүүд нь хорт хавдрын эсийн өвөрмөц шинж чанарыг харуулж болох бөгөөд энэ нь транскрипцийн зохицуулалт нь хорт хавдрын эмчилгээнд маш сайн арга байж болохыг харуулж байна (Drost et al., 2017). Эмийн хөгжилд генетикийн, эпигенетикийн болон транскрипцийн гажиг зэрэг хавдрын эдгээр молекулын шинж чанарыг ашиглах нь эмнэлзүйн үр дүнг сайжруулж, скринингийн зардлыг бууруулж чадна. CRISPR нь зөвхөн хорт хавдар үүсгэдэг геномын байг илрүүлж, тодорхойлохоос гадна хүний ​​эсийн онкогенийг засах, дарангуйлах, эпигенетикийн хувьд өөрчлөхөд ашиглаж болох генийн засварлах хэрэгсэл юм (Хүснэгт 1) (Ahmed et al., 2021). Хавдрын дарангуйлагч, онкоген, эмийн эсэргүүцэлтэй холбоотой генийг хайхын тулд хэд хэдэн CRISPR шинжилгээ хийсэн. Төрөл бүрийн TNBC онкогенийг засварлахад CRISPR/Cas9 ашиглахыг Зураг 2-т үзүүлэв.
Зураг 2. CRISPR/Cas9 ашиглан янз бүрийн TNBC онкогенүүдийн генийг засварлах нь хавдрын өсөлт болон үсэрхийллийг бууруулдаг. Эдгээр онкогенүүдэд TNBC-ийн үүсэл болон үсэрхийлэлд оролцдог CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 болон CXCR7, Crypto1, ROR1 болон ST8SIA орно.
Хорт хавдрын эсийн шилжилт хөдөлгөөн, инвази, хучуур эдийн мезенхимийн шилжилт (EMT) нь ITGA9-тэй холбоотой байдаг. Өмнөх судалгаагаар ITGA9 нь Notch замын гол тоглогч бөгөөд рабдомиосаркомын үсэрхийлэлд сонирхолтой үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулсан (Molist et al., 2020). Үүнээс гадна, ITGA9 нь хөхний хорт хавдар зэрэг хэд хэдэн хавдрын өвчтний тавилантай нягт холбоотой болохыг тогтоосон (Wang Z. et al., 2019). Үүнээс гадна, ITGA9-ийн биоинформатик шинжилгээгээр TNBC-д түүний илэрхийлэл нь хөхний хорт хавдрын бусад дэд хэвшлүүдээс мэдэгдэхүйц өндөр байгааг харуулсан. ITGA9-ийн түвшин өндөр байх нь TNBC өвчтөнүүдэд хавдрын үсэрхийлэл болон дахилттай холбоотой байдаг. CRISPR/Cas9-ийн тусламжтайгаар ITGA9-ийг нокаут хийснээр хорт хавдрын үүдэл эс (CSC) төст шинж чанар, хавдрын ангиогенез, хавдрын өсөлт, TNBC-д β-катенины задралыг дэмжих замаар үсэрхийлэл буурсан (Wang Z. et al., 2019).
Крипто-1 нь TGF-β бүлгийн гишүүн бөгөөд үр хөврөлийн эхэн үе, үүдэл эсийн хадгалалт, хорт хавдрын үсэрхийлэлд чухал үүрэгтэй (Ishii et al., 2021). Мөн Tdgf-1 гэгддэг энэ нь анхдагч судал, мезодерм ба эндодерм үүсэхийг зохицуулах, мөн үр хөврөлийн үед биеийн эрхтнүүдийн хөгжилд зүүн/баруун тэгш бус байдлыг бий болгоход оролцдог онкогенийн GPI-ээр бэхлэгдсэн дохиоллын уураг юм (Zhang et al., 2021b). Нэмж дурдахад, Крипто-1 нь үүдэл эсийн маркер болох хучуур эдийн мезенхимийн шилжилтэд (EMT) оролцдог болох нь батлагдсан (Zhang et al., 2021b). EMT нь зөвхөн үр хөврөлийн хөгжил, фиброз, шарх эдгэрэлт зэрэг янз бүрийн үйл явцад төдийгүй хорт хавдрын нэвчилт болон үсэрхийлэлд чухал үүрэгтэй. Нэмж дурдахад, Крипто-1 нь дөрвөн Notch рецептортой харилцан үйлчилж, тэдгээрийн орчуулгын дараах боловсорч гүйцэлтийг сайжруулдаг болохыг харуулсан (Brandstadter and Maillard, 2019). Notch дохиоллын зам нь хүний ​​хөхний хорт хавдрын эсийг хадгалахад оролцдог гэдгээрээ алдартай. Судалгаагаар CRISPR/Cas9-ээр зуучлагдсан Crypto-1-ийн нокаут нь хорт хавдрын өсөлт болон үсэрхийллийг дарангуйлдаг болохыг харуулсан. Тиймээс Crypto-1 нь TNBC-ийн чухал эмчилгээний бай болж магадгүй юм (Castro et al., 2015).
XCL12 уураг болон түүний хемокин рецептор CXC (CXCR4 ба CXCR7) нь хорт хавдрын эсийн үржил, өсөлт, шилжилт хөдөлгөөн болон инвазид янз бүрийн үүрэг гүйцэтгэдэг (Wu et al., 2015). Эдгээр хеморецепторууд нь in vivo болон in vitro загваруудад олон дохиоллын замаар дамжин TNBC-ийн хөгжилтэй холбоотой байсан (Wu et al., 2015). Үүнээс гадна, CXCR4 ба CXCR7-ийн идэвхжил нь TNBC-д үсэрхийлэлд өртөмтгий байдал нэмэгдэж, тавилан муутай холбоотой байдаг (Karn et al., 2022). Тиймээс CXCR4 ба CXCR7-ийн нокаут нь TNBC зэрэг хөхний хорт хавдрыг эмчлэхэд үр дүнтэй эмийн зорилтот ген болж болзошгүй юм. Ян болон бусад судлаачдын судалгаагаар Ян болон бусад (2019) CRISPR/Cas9-ийг ашиглан CXCR4 ба CXCR7 генийг хамтран нокаут хийж, TNBC-ийн үржил, өсөлт, шилжилт хөдөлгөөн болон инвазив үйл явцыг мэдэгдэхүйц дарангуйлсан болохыг тогтоожээ (Yang et al., 2019).
Хөхний хорт хавдрын эдэд TNBC онкоген болох miR-3662-ийн түвшин нэмэгдсэн нь ажиглагдсан (Yi et al., 2022). miR-3662-ийн дарангуйлал нь хөхний хорт хавдрын өсөлт, үсэрхийллийг in vivo болон in vitro аль алинд нь дарангуйлдаг болохыг харуулсан (Agarwal and Gupta, 2021). HBP-1 нь Wnt/-катенины дохиоллын хүчтэй дарангуйлагч бөгөөд TNBC эсийн miR-3662-оор дамждаг өсөлтийг хариуцдаг байх магадлалтай. Саяхан Yi et al. miR-3662-HBP1 тэнхлэг нь TNBC эсүүдэд Wnt/-катенины дохиоллын замыг зохицуулдаг болохыг тогтоожээ (Yi et al., 2022). Хавдрын өвөрмөц илэрхийлэлтэй тул miR-3662 нь TNBC-ийн эмчилгээний боломжит зорилт байж болно. Тиймээс CRISPR/Cas9-оор дамждаг miR-3662-ийн дарангуйлал нь TNBC-ийн эмчилгээнд зориулсан шинэ эм боловсруулах маш сайн арга байж болох юм.
UBR5 нь янз бүрийн хорт хавдрын үед хавдар үүсэх, үсэрхийлэл үүсэх, дархлааны хариу урвалын гол зохицуулагч гэж тодорхойлогдсон 300 кДа нуклеофосфопротеин юм (Ширер нар, 2015; Фу нар, 2023). UBR5 нь TNBC дээжинд өндөр зохицуулалттай бөгөөд убиквитин лигазын идэвхжилээрээ дамжуулан үржлийг өдөөснөөр ERα үйл ажиллагааг идэвхжүүлдэг гэж мэдээлсэн (Болт нар, 2015). Анхдагч TNBC дээжийн экзомын дарааллын бүхэл бүтэн судалгаагаар UBR5-ийн экспресс нэмэгдсэн нь TNBC-ийн хөгжилд түүний үүрэг гүйцэтгэж байгааг харуулж байна. Нэмж дурдахад, UBR5-ийн CRISPR/Cas9-ээр удирдуулсан устгал нь туршилтын хулганы загварт TNBC-ийн үсэрхийлэл болон өсөлтийг мэдэгдэхүйц дарангуйлдаг болохыг харуулсан. Түүнчлэн, зэрлэг хэлбэрийн хулганы загварт UBR5-ийг оруулах нь түүний бүрэн ажиллагааг сэргээсэн бол идэвхгүйжүүлсэн мутант омгуудад энэ нөлөө ажиглагдаагүй (Лиао нар, 2017). UBR5-ийн дутагдал нь TNBC-д апоптоз, үхжил нэмэгдэх, ангиогенез муу байгаагаас болж хавдрын өсөлтийг дарангуйлахтай холбоотой юм. UBR5-ийн алдагдалаас болж хавдрын тархалт багасч, UBR5 нь голчлон E-кадгерин экспрессийг бууруулснаар хэвийн бус EMT-ийг өдөөдөг (Zhang and Weinberg, 2018). Саяхан UBR5 нь E3 убиквитинжуулалтын идэвхжилгүй тул TNBC-д IFN-γ-ээр өдөөгдсөн PDL1 транскрипцид маш чухал хүчин зүйл болдог болохыг харуулсан. РНХ транскриптомын шинжилгээгээр UBR5 нь IFN-γ замтай холбоотой генүүдэд системийн нөлөө үзүүлж, уураг киназын РНХ (PKR) болон түүний дохионы дамжуулагч, идэвхжүүлэгчдийн идэвхжүүлэлтийн түвшинг нэмэгдүүлснээр PDL1 транскрипцийг идэвхжүүлдэг болохыг тогтоожээ. транскрипц 1 (STAT1) ба интерфероны зохицуулагч хүчин зүйл 1 (IRF1). Гэсэн хэдий ч CRISPR/Cas9-аар зуучилсан UBR5 болон PD-L1 экспрессийн хосолсон абляци нь дангаар нь блокадаас илүү синергетик эмчилгээний үр нөлөөтэй бөгөөд хавдрын бичил орчинд гүнзгий нөлөө үзүүлдэг (Wu et al., 2022). Тиймээс CRISPR/Cas9 нь UBR5-ийн үйл ажиллагааг дарангуйлах, улмаар TNBC-ийн метастаз болон хавдрын өсөлтийг дарангуйлах чухал хэрэгсэл байж болох юм.
ROR1 нь хорт хавдар болон үр хөврөлийн хөгжлийн үед илэрхийлэгддэг I хэлбэрийн трансмембран уураг бөгөөд ургийн онкофетал уураг гэж тодорхойлогдсон (Николас Борчердинг, 2014). Хүний янз бүрийн хорт хавдрын инвазив зан үйл нь ROR1-ийн зохицуулалт нэмэгдэхтэй холбоотой байдаг. ROR1-ийг чиглүүлсэн эмчилгээний нэгдлүүдийг хамарсан in vivo болон in vitro судалгаанаас ирээдүйтэй үр дүнг авсан (Chien et al., 2016). Хөхний эдийн биопсийн ROR1 мРНХ-ийн түвшин өндөр байх нь түрэмгий суурь төст хөхний (BL) хавдар болон биеийн бусад хэсэгт шилжихтэй холбоотой байсан. Түүнчлэн, ROR1-ийн хэт их илэрхийлэл нь TNBC-ийн хөгжлийн тавилантай тэмдэглэгээ гэж тодорхойлогдсон (Chien et al., 2016). Гэсэн хэдий ч TNBC-ийн өсөлт болон үсэрхийллийг дарангуйлахын тулд CRISPR/Cas9 ашиглан ROR1-ийг чимээгүй болгох нь үр дүнтэй стратеги байх болно.
Сиалилжуулалтын процесс нь гликоконьюгатуудад сиалийн хүчил нэмэхийг хамардаг бөгөөд энэ нь сиалилтрансфераза (STs)-ээр катализждаг. ST8SIA1 нь ST гэр бүлд багтдаг бөгөөд лимфоцитын лейкеми, бүдүүн гэдэсний хорт хавдар зэрэг янз бүрийн өвчний эмгэг жамд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг (Chang et al., 2018). РНХ-ийн дарааллын шинжилгээгээр ST8SIA1 нь TNBC өвчтөнүүдийн хөхний эдэд өндөр хэмжээгээр илэрхийлэгддэг бөгөөд хавдрын дарангуйлагч ген p53-ийн мутацитай эерэг хамааралтай байдаг бөгөөд энэ нь TNBC-ийн эмгэг жамд нөлөөлж болзошгүй (Battula et al., 2017). Үүнээс гадна, ST8SIA1 нь TNBC-ийн үсэрхийлэл болон дахилтад оролцдог бөгөөд энэ нь TNBC-ийн үүсэл, хөгжилд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна. TNBC-ийн in vitro загварт CRIPSR/Cas9-ээр ST8SIA1-ийг нокдаун хийх нь өсөлт болон үсэрхийлэлийг хааж байгааг харуулсан (Battula et al., 2017). Энэ нь CRISPR/Cas9 нь TNBC-ийн эмчилгээнд ST8SIA1 онкогенийн үйл ажиллагааг дарангуйлах чухал хэрэгсэл байж болохыг харуулж байна.
NAT1 нь II үе шатны ксенобиотик нэгдлүүдийн үүсэлтийг хурдасгадаг бодисын солилцооны фермент бөгөөд бараг бүх хүний ​​эд эсэд илэрхийлэгддэг. NAT1 нь ароматик амин субстрат байхгүй байсан ч ацетил-КоА (ацетил-КоА)-г онилохын тулд кофактор фолатыг ашиглаж чаддаг (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Судалгаагаар NAT1 нь хөхний хорт хавдрын эсийн загварт матриц металлопротеиназа 9 (MMP9)-ийн үйл ажиллагааг зохицуулж, глюкозын өлсгөлөнгийн үед реактив хүчилтөрөгчийн төрөл зүйлээс (ROS) хамгаалдаг болохыг харуулсан (Wang et al., 2018). NAT1-ийг устгах нь пируват дегидрогеназын цогцолборыг дарангуйлж, митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалд хүргэдэг болохыг харуулсан (Wang L. et al., 2019). Нэмж дурдахад, жижиг молекулууд болон siRNA-г чимээгүйжүүлэлтийг ашиглан NAT1-ийг дарангуйлах нь хөхний хорт хавдрын эсийн инвазив байдал болон тархалтыг бууруулж болохыг бусад янз бүрийн тайланд харуулсан (Stepp et al., 2018). Саяхан CRISPR/Cas9-ийг хөхний хорт хавдрын эсийн шугам MDA-MB-231-д NAT1-ийг дарангуйлахад ашигласан бөгөөд энэ нь түүний илэрхийлэлийн түвшингээс хамааран эсийн бодисын солилцоонд нөлөөлдөг. Энэхүү судалгаагаар NAT-1 нь TNBC-ийн явц болон үсэрхийлэлд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулсан (Carlisle et al., 2020).
Онкогенийн зохицуулалттай транскрипцийг супер сайжруулагч, транскрипцийн хүчин зүйлс болон кофакторууд зохицуулдаг (Hnisz et al., 2015). Үүнээс гадна, CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, болон CDK13 зэрэг циклинээс хамааралтай киназуудын бүлэг (CDK) нь транскрипцийн зохицуулалтад шаардлагатай байдаг. Тэдгээрийн дотроос CDK7 нь РНХ полимераза II-ийн фосфоржуулалтад оролцдог бөгөөд энэ нь TNBC-ийн эмгэг жамд онкогенийн транскрипцийг эхлүүлэх, өргөжүүлэхэд маш чухал юм. Нэгэн чухал судалгаагаар CRISPR/Cas9-ээр CDK7-г устгах нь TNBC-г дарангуйлсан нь TNBC-ийн эмгэг жам нь CDK7-ээс хамааралтай болохыг харуулж байна (Wang Y. et al., 2015).
Судалгаагаар MYC болон RBP (РНХ холбогч уураг)-ын мутаци нь апоптоз үүсгэдэг бол MYC эсвэл RBP-ын дан генийн мутаци нь хорт хавдрын эсийн өсөлтөд нөлөөлдөггүй болохыг харуулсан (Эйнштейн нар, 2021). Хүний геномын 1000 гаруй RBP-ийг CRISPR/Cas9 дээр суурилсан номын сан ашиглан шинжилсэн. Тэдгээрийн дотроос 57 RBP нь MYC-ийн өндөр түвшинтэй хорт хавдрын эсийн өсөлтөд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг тогтоосон (Wheeler нар, 2020). Үүнээс гадна, YTHDF2 нь TNBC эсийн өсөлтийг хадгалахад чухал үүрэгтэй бөгөөд MYC-ийн экспресс өндөртэй хорт хавдрын эсүүдэд өндөр түвшний транскрипц болон орчуулгын үед метилжүүлсэн транскрипцийн хэмжээг бууруулдаг. Нэмж дурдахад, YTHDF2 нь TNBC өвчтөнүүдийн амьдрах хугацааг уртасгахын тулд MYC-ийн өндөр түвшингээс бага хамааралтай хорт хавдрын эсүүдэд чухал биш юм (Эйнштейн нар, 2021), энэ нь TNBC-ийг даван туулж чадах эмийн эмчилгээний зорилтот зорилт байж болохыг харуулж байна.
Цайрын хурууны уургууд (ZNFs) нь хүний ​​нийт геномын ойролцоогоор 1%-ийг эзэлдэг. Судалгаагаар ZNF нь элэгний хорт хавдар, хөхний хорт хавдар, бүдүүн гэдэсний хорт хавдар зэрэг янз бүрийн хорт хавдрын эсийн үржлийг зохицуулж чаддаг болохыг харуулсан (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). CRISPR нокаутаар үүсгэгдсэн сангуудыг хөхний хорт хавдрын эсүүдэд янз бүрийн хавдрын дарангуйлагч генийг (TSGs) илрүүлэхэд ашиглаж ирсэн (Shalem et al., 2014). Түүнээс хойш CRISPR/Cas9 ZNF319-ээр устгагдсан хөхний хорт хавдрын эсүүдийн транскриптомик судалгаагаар ZNF319 нь хөхний хорт хавдрын үржлийг бууруулдаг хавдрын дарангуйлагч ген бөгөөд улмаар янз бүрийн дохиоллын механизм болон бусад биологийн функцүүдэд оролцдог болохыг харуулсан (Wang L. et al., 2022).
Ферроптоз нь төмрийн агууламжаас хамааралтай програмчлагдсан эсийн үхлийн нэг төрөл юм. Ферроптозын хөгжилд липидийн хэт исэл нөлөөлдөг нь мэдэгдэж байна. Үүнээс гадна, PKCβII нь липидийн хэт исэлжилтийг эрт үед үзүүлдэг бөгөөд липидийн хэт исэлжилт нэмэгдэх нь ферроптозтой холбоотой байдаг гэж мэдээлсэн. CRISPR/Cas9-зуучлалтай киназын дарангуйлагчдын санг шинжилснээр PKCβII нь липидийн хэт исэлжилтийн процесст оролцдог бөгөөд энэ нь MDA-MB-231 эсүүдэд ферроптозын хувьд чухал ач холбогдолтой болохыг тогтоожээ (Zhang et al., 2022). Тиймээс энэ нь CRISPR/Cas9-ээр PKCβII-ийг нокаут хийх нь ферроптозтой холбоотой өвчнийг эмчлэхэд хавдрын дарангуйлагч генийн бай болж болзошгүйг харуулж байна (Zhang et al., 2022).
Эмийн эсэргүүцэл нь хорт хавдартай өвчтөнүүдийн нас баралтын ойролцоогоор 90%-ийг эзэлдэг гэж үздэг бөгөөд хорт хавдрын эмчилгээний гол бэрхшээлүүдийн нэг юм (Bukowski et al., 2020). Үр дүнгээс харахад эмийн гадагшлах урсгал, ДНХ-ийн нөхөн сэргээлт, апоптоз болон янз бүрийн эсийн дохиоллын замуудтай холбоотой хангалттай тооны генүүд эмийн эсэргүүцэлтэй холбоотой байдаг (Haider et al., 2020). Тэдгээрийн дотроос хэд хэдэн генийг CRISPR/Cas9 хэрэгслээр чиглүүлж, эмийн эсэргүүцлийг бууруулж, хорт хавдрын эсрэг эмчилгээний үр нөлөөг нэмэгдүүлэхэд ирээдүйтэй үр дүнг харуулсан (Vaghari-Tabari et al., 2022). Үүнээс гадна, өндөр хүчин чадалтай CRISPR/Cas9 генийн нокаут скрининг номын сангууд нь эмийн эсэргүүцлийн генийн боломжит зорилтуудын үйл ажиллагааг өөрчлөхөд оролцдог (Shalem et al., 2015). Паклитакселийн эсэргүүцлийн генийг тодорхойлохын тулд геномын хэмжээнд sgRNA номын сангийн скринингтэй хослуулан РНХ-ийн дарааллыг ашигласан бөгөөд энэ нь TNBC дахилттай өвчтөнүүдэд эмийн эсэргүүцэлтэй холбоотой гистон деацетилаза 9 (HDAC9) зэрэг найман нэр дэвшигч генийг тодорхойлсон (B et al., 2020). Өөр нэг судалгаагаар хорт хавдрын эсрэг эмээр эмчилсэн TNBC өвчтөнүүдийн амьд үлдэх хугацаанд дизерин/треонин ба тирозин уураг киназын (DSTYK) экспресс нэмэгдсэн нь ажиглагдсан. Түүнчлэн, DSTYK-ийн CRISPR/Cas9-зуучлалтай нокаут нь in vitro эмэнд тэсвэртэй хорт хавдрын эсийн апоптозыг (SUM102PT эсүүд ба MDA-MB-468 эсүүд) болон in vivo TNBC загварыг мэдэгдэхүйц сайжруулсан (Ogbu et al., 2021).
TNBC нь MAPK замын хэвийн бус идэвхжилтэй боловч MEK-т чиглэсэн эмчилгээний эмнэлзүйн үр нөлөө муу байна. CRISPR/Cas9 геномын номын сангийн дэлгэцээр PSMG2 (протеом угсралтын шаперон 2)-ийг дарангуйлах нь TNBC BT549 болон MB468 эсүүдийг MEK дарангуйлагч AZD6244-д мэдрэгжүүлдэг болохыг харуулсан. PSMG2-ийн CRISPR/Cas9-ийг дарангуйлах нь протеазомын хэвийн үйл ажиллагааг өөрчилж, PDPK1-ийн аутофагигаар дамжин задрахад хүргэж, улмаар AZD6244 (MEK дарангуйлагч) болон MG132 (протеазомын дарангуйлагч)-аар өдөөгдсөн TNBC хулганы загварт хавдрын эсүүдийг улам сайжруулсан. Тиймээс протеазом болон MAP киназа (MEK) дарангуйлагчдыг хавдрын эсийн үржлийг бууруулахын тулд синергетик байдлаар хэрэглэж болно (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9-ийг мөн TNBC-д тэсвэртэй болоход хүргэдэг генийн үйл ажиллагааны алдагдалыг илрүүлэхэд ашигласан (Shu et al., 2020). Ge et al. нь TNBC-д BET бромодомейн дарангуйлагч (BBDI) болох JQ1-ээр эмчилсэн хорт хавдрын эсийн эмийн эсэргүүцлийн механизмыг тайлбарласан. CRISPR/Cas9-ийг ашиглан тэд rb1 генийг устгах нь TNBC-ийг хорт хавдрын эсрэг JQ1 эмэнд тэсвэртэй болгодог болохыг тогтоожээ. Тиймээс rb1 функц нь TNBC-д JQ1 эмэнд үзүүлэх хариу урвалд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг. Тэд мөн паклитаксел нь CDK4/6 киназа/микротубулын дарангуйлагч бөгөөд JQ1 зэрэг BBDI-тэй хослуулан хэрэглэх нь эмэнд тэсвэртэй TNBC-д ирээдүйтэй эмчилгээний хариу урвал үзүүлж болзошгүй гэж мэдээлсэн (Ge et al., 2020).
Урт кодчилдоггүй РНХ (lncRNA)-ийн транскрипцийн ландшафт нь TNBC-д неоадъювант эмчилгээнд тэсвэртэй болоход нөлөөлдөг гэж мэдээлсэн. Энэхүү судалгаагаар таван өөр MALAT1 lncRNA транскрипц нь TNBC-д өндөр илэрхийлэгддэг болохыг харуулж байна. Нэмж дурдахад, MALAT1-ийн CRISPR/Cas9-ээр дамжуулан устгал нь TNBC BT-549 эсийн паклитаксел болон доксорубицинд мэдрэг чанарыг нэмэгдүүлсэн нь TNBC-д MALAT1-ийн эсэргүүцэл үүсэх боломжтойг харуулж байна (Shaath et al., 2021).
BRCA1 (BRCA1m)-ийн мутаци нь олон янз байдаг тул илрүүлэхэд хэцүү байдаг. BRCA1-ийн синтетик үхлийн түнш болох PARP1 (поли(ADP-рибоз) полимераза)-г онилох нь TNBC эмийн химио мэдрэг чанарыг нэмэгдүүлж болзошгүй юм. CRISPR/Cas9-ийг ашиглан PARP1-ийг устгах нь доксорубицин, гемцитабин, доцетаксел зэрэг хорт хавдрын эсрэг эмийн mBRCA1 мутант TNBC эсүүдэд мэдрэг чанарыг нэмэгдүүлсэн бөгөөд энэ нь PARP1 нь TNBC-д эмийн эсэргүүцэлд оролцдог болохыг харуулж байна (Vaghari-Tabari et al., 2022). Хавдрын дарангуйлагч ген болох BRCA1 эсвэл BRCA2-ийн мутаци нь хүмүүст хөхний хорт хавдар үүсэх магадлалыг нэмэгдүүлдэг нь мэдэгдэж байна. Эдгээр өвчтөнүүдийг эмчлэхэд PARP дарангуйлагч хэрэглэх шаардлагатай. Түүнчлэн, CRISPR/Cas9 ашиглан нуклеотидын аврах хүчин зүйл DNPH1-ийг нокаутлах нь хортой нуклеотид 5-гидроксиметилдеоксиуридин (hmdU) монофосфатыг зайлуулж, улмаар BRCA дутагдалтай эсүүдийн PARP дарангуйлагчдад мэдрэмтгий байдалд үзүүлэх хариу урвалыг сайжруулдаг болохыг харуулсан (Fugger). et al., 2021). Тиймээс CRISPR/Cas9 болон PARP1 дарангуйлагчид нь TNBC-ийн эмчилгээний чухал стратеги болж магадгүй юм.
Нэвтрэх гликопротеин (P-gp) ген нь олон эмийн эсэргүүцлийн ген бөгөөд ерөнхийдөө бүх TNBC-ийн ойролцоогоор 41%-д нэмэгддэг (Sun et al., 2020). P-gp-ээр өдөөгдсөн эмийн гадагшлах урсгал нь хөхний хорт хавдрын эмийн эсэргүүцлийн гол зохицуулагч болохыг тогтоосон. P-gp дарангуйлагчид хөхний хорт хавдрын эсрэг эмэнд мэдрэмтгий чанар нэмэгдсэн болохыг харуулсан (Famta et al., 2021). Тиймээс CRISPR/Cas9-ээр зуучлагдсан P-gp болон P-gp дарангуйлагчдыг абляци хийх эсвэл дарангуйлах нь TNBC-ийн эмийн эсэргүүцлийг даван туулах маш чухал аргууд байж болох юм.
ATP-холбогч кассет дамжуулагч G2 (ABCG2) нь TNBC-д эмийн эсэргүүцэл үүсгэдэг нь мэдэгдэж байгаа (Palasuberniam et al., 2015), гэхдээ CRISPR/Cas9 болон ABCG2-ийг чимээгүй болгох болон хавдрын дарангуйлагч генийг идэвхгүйжүүлэх хоёрын хоорондын хамаарлын талаар одоогоор мэдээлэл алга байна. PTEN нь ABCG2-ийн идэвхжлийг сайжруулж болзошгүй (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Тиймээс CRISP/Ca9 ашиглан ABCG2-ийг устгаж, ABCG2 дарангуйлагчтай хослуулах нь TNBC-д эмийн эсэргүүцлийг даван туулах тохиромжтой эмчилгээ байж болох юм. Хүснэгт 2-т CRISPR/Cas9 нь бүх эсэргүүцлийн генийг чиглүүлдэг болохыг дурдсан.
Хүснэгт 2. CRISPR/Cas9 нь эсийг хорт хавдрын эсрэг эмэнд мэдрэг болгохын тулд янз бүрийн TNBC эсэргүүцлийн генийг чиглүүлдэг.
CRISPR/Cas9 сангууд нь хорт хавдрын эмгэг жамтай холбоотой генийн мутацийг илрүүлэх боломжит хэрэгсэл юм (Chan et al., 2022). Энэхүү илрүүлэх арга нь (a) санг байгуулах, (b) лентивирусын дамжуулалт, (c) фенотипийн скрининг, (d) зорилтот генийн шинжилгээ зэрэг дөрвөн үе шатыг хамардаг. TNBC нь MAPK замын хэвийн бус идэвхжилтэй боловч PTEN, RB1, TP53 зэрэг хавдрын дарангуйлагч генийн мутацитай TNBC өвчтөнүүдийн MEK зорилтот эмчилгээний клиник тавилан маш муу байна.
Түүнчлэн, CRISPR/Cas9 ашиглан хийсэн генийн нокаут скрининг нь Гватемалын цэцэг, навчны ханданд элбэг байдаг хамгийн хүчтэй, сонгомол молекул болох дегидрокатролыг туршиж үзсэн бөгөөд дегидрокатролын MDA-MB-231-д үзүүлэх нөлөөг ойлгосон. Сонгомол эсийн цитотоксик чанар. TNBC дэд хэвшлийн мезенхимийн үүдэл эсийн шинж чанар. Энэхүү CRISPR/Cas9 дээр суурилсан скрининг нь 11-р төрлийн 17β-гидроксистероид дегидрогеназа кодчилдог ген болох HSD17B11 нь MDA-MB-231 эсүүдэд өндөр илэрхийлэгддэг бөгөөд MDA-MB-231 эсүүдэд өвөрмөц дегидрофалькаринол үүсгэдэг болохыг харуулсан (Grant et al., 2020). Тиймээс энэ нь CRISPR/Cas9 геномын скрининг нь байгалийн гаралтай нэгдлүүдийн хорт хавдрын эсрэг шинж чанарын үндэс суурь болсон механизмыг тодорхойлоход маш их боломжтой болохыг харуулж байна.
Үүнээс гадна, TNBC-ийн хорт хавдрын эмзэг байдлыг геномын хэмжээнд in vivo CRISPR/Cas9 скрининг ашиглан судалсан бөгөөд энэ нь онкоген болон хавдрын дарангуйлагч замын хоорондын холбоог харуулсан. mTOR болон Hippo замын гол бүрэлдэхүүн хэсгүүд нь TNBC-д хавдрын зохицуулалтад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг гэж мэдээлсэн. Нэмж дурдахад, судалгаагаар mTORC1/2 болон YAP онкопротеины фармакологийн дарангуйлал нь in vitro эмийн матрицын синергийн загвар болон in vivo өвчтөнөөс гаралтай ксенотрансплантатыг ашиглан TNBC-ийн эмгэг төрүүлэгч чанарыг үр дүнтэй дарангуйлдаг болохыг харуулсан. Түүнчлэн, Торин-1-ээр зуучлагдсан mTORC1/2 дарангуйлал нь макропиноцитозыг нэмэгдүүлдэг бол вертепорфиноор өдөөгдсөн YAP дарангуйлал нь TNBC эсийн үхэлд хүргэдэг. Эдгээр үр дүнгүүдийг нэгтгэн үзвэл TNBC-ийн шинэ бөгөөд үр дүнтэй эмчилгээг тодорхойлохын тулд геномын хэмжээнд in vivo CRISPR скрининг хийх хүч чадал, бат бөх чанарыг онцолж байна (Dai et al., 2021).
Дархлааны тогтолцооны зохицуулалтын алдагдал нь хавдар үүсэх чухал хүчин зүйл юм. Хорт хавдрын эсүүд нь хавдрын бичил орчин дахь дархлааны эсүүдийн үйл ажиллагаанд саад учруулж, дархлааны системийг алдагдуулах зэрэг хамгаалалтын механизмыг тойрч дархлааны цэвэршилтээс зайлсхийдэг. Тиймээс сайжруулсан дархлааны системийг хөгжүүлэх нь хавдартай тэмцэх гол арга байж болох юм. CRISPR/Cas9 дээр суурилсан генийн өөрчлөлтийг ашиглах нь дархлааны үйл ажиллагааны алдагдалтай холбоотой хэд хэдэн асуудлыг өөр өөр өнцгөөс авч үздэг. CRISPR/Cas9-ийг хөхний хорт хавдрын эсрэг хавдрын эсрэг дархлааг дараах замаар сайжруулахад ашиглаж ирсэн (Зураг 3).
Зураг 3. CRISPR/Cas9 дархлаа эмчилгээ нь TNBC эсүүдийг чиглүүлдэг. CDK5-ийн алдагдал болон PDL1 болон CD155-ийн нокаут нь дархлааны системийг сайжруулдаг. Үүнтэй адил A2AR-ийн алдагдал болон HER2, муцин 1 болон TEM8 зэрэг TAA-ийн нокаут нь хорт хавдрын эсийг устгах CAR-T эсийн үр нөлөөг нэмэгдүүлсэн. CRISPR/Cas9-ээр удирдуулсан Т эсийн скрининг нь p38 киназын тасалдал нь Т эсийн хавдрын эсрэг үйл ажиллагааг нэмэгдүүлдэг болохыг харуулсан. CRISPR/Cas9-ээр өөрчлөгдсөн Т эсүүд нь TCR (Т эсийн рецептор)-ийн экспрессийг нэмэгдүүлж, улмаар Т эсүүд хавдрын эсрэг үйл ажиллагаатай болдог.
Дархлаа эмчилгээний зорилго нь дархлааны системийг хорт хавдрын эсүүдэд халдахыг өдөөх явдал юм. Дархлааны хяналтын цэгийн уургийн хэт их илэрхийлэл нь ихэвчлэн аутоиммун урвалаас сэргийлдэг боловч хорт хавдраас зайлсхийхэд тусалдаг (Топалиан нар, 2015). Эдгээр уургууд нь дархлааны эсийн гадаргуу дээрх рецепторуудтай холбогдож дархлааны урвалаас сэргийлдэг. Олон хяналтын цэгийн уургууд (CD155 ба PD-L1 гэх мэт) нь дархлааны эсүүд дээрх PD-1 рецепторыг чиглүүлдэг бөгөөд хөхний хорт хавдар, ялангуяа TNBC-д илэрхийлэгддэг (Li Y.-C. нар, 2020). CRISPR/Cas9 ашиглан PD-L1 эсвэл түүний рецепторыг дарангуйлах нь дархлааны системийг TNBC хавдар руу халдахыг өдөөж болно (Yahata нар, 2019). Нэмж дурдахад, CRISPR/Cas9-ээр дамжуулан CDK5-ийг устгах замаар PD-L1-ийн илэрхийлэлийг бууруулах нь in vitro болон in vivo хавдрын өсөлтийг дарангуйлдаг болохыг харуулсан (Deng нар, 2020). Хөхний хорт хавдрын in vitro болон in vivo загварт өсөлтийг дарангуйлах нь shRNA-аар зуучлагдсан CD155-ийн бууралт нь хөхний хорт хавдрын эмчилгээний үр нөлөөтэй байж болохыг харуулж байна (Gao et al., 2018).
CAR Т эсүүд нь хавдартай холбоотой антиген (TAA)-г таньдаг CAR-г илэрхийлдэг бөгөөд үйл ажиллагаагаа сайжруулахын тулд хяналтын цэгийн уургуудыг нокдаун хийж чаддаг (Li C. et al., 2020). Хөхний хорт хавдрын үед CAR Т эсийн эмчилгээний янз бүрийн боломжит зорилтууд байдаг бөгөөд үүнд HER2, mucin1, TEM8 зэрэг хэд хэдэн TAA орно (Bajgain et al., 2018). Мезотелиныг чиглүүлсэн CAR Т эсүүд (TNBC BT-459 эсүүдэд хэт их илэрхийлэгдсэн) нь PD-1-ийг CRISPR/Cas9 ашиглан нокдаун хийхэд хорт хавдрын эсрэг илүү үр дүнтэй байдаг гэсэн нотолгоо байдаг (Hu et al., 2019). Гэсэн хэдий ч өвчтөнүүдээс Т эсийг тусгаарлаж, дараа нь тэдгээрийг ex vivo засварлах нь хөдөлмөр их шаарддаг бөгөөд цаг хугацаа их шаарддаг үйл явц юм. Бүх нийтийн Т эсүүд тусгаарлах шаардлагыг бууруулж чаддаг ч хүний ​​лейкоцитын эсрэг антиген (HLA) I ангиллын антиген (HLA) болон Т эсийн рецептор (TCR) илэрхийлдэг донор Т эсүүдийг шилжүүлэн суулгах эсийн эсрэг эзэний гажиг үүсэхээс урьдчилан сэргийлэхийн тулд зайлуулах хэрэгтэй (Ren et al., 2017). , 2017a). CRISPR/Cas9 ашиглан HDR нь TCR болон HLA-г нэгэн зэрэг арилгаж, CAR-г кодчилдог генийг устгаж чадна. Судалгаагаар CRISPR/Cas9-ийг TCR локус руу CD19-ийн эсрэг CAR-г нэвтрүүлэхэд ашиглаж болох бөгөөд ингэснээр Т эсийг устгахгүйгээр CAR-г үр дүнтэй үйлдвэрлэх боломжтой болохыг харуулсан (Dimitri et al., 2022). TCR, бета-2-микроглобулин (B2M), HLA-I дэд нэгж болон PD-1 болон CTLA-4 зэрэг бусад уургуудыг нэгэн зэрэг устгаснаар аллоген CAR T эсийг үүсгэх мультиплекс технологиудыг боловсруулсан бөгөөд эдгээр нь TNBC-ийн эсрэг хорт хавдрын эсрэг илүү сайн шинж чанартай байж болзошгүй (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
CRISPR/Cas9-ийг хэрэглэх нь CAR-T эсийн үр нөлөөг сайжруулж чадна. Аденозин нь дархлаа дарангуйлах шинж чанартай бөгөөд Т эсийн үйл ажиллагааг хааж, аденозин A2A рецепторуудыг (A2AR) идэвхжүүлснээр хорт хавдрын эсрэг дархлааг бууруулдаг (Vigano et al., 2019). CRISPR/Cas9 ашиглан A2AR-ийг чимээгүй болгох нь CAR-T эсийн in vivo үр нөлөөг мэдэгдэхүйц сайжруулсан (Giuffrida et al., 2021). Т эсүүд нь эсийн тэлэлт, ялгаварлан гадуурхалт, исэлдэлтийн стресс, геномын стресс зэрэг янз бүрийн фенотипийн шинж чанарыг харуулдаг нь мэдэгдэж байна. CRISPR/Cas9 дээр суурилсан Т эсийн скрининг нь 25 өөр Т эсийн рецепторын киназыг тасалдуулсан болохыг илрүүлсэн. Тэдгээрийн дотроос p38 киназын устгал нь Т эсийн хавдрын эсрэг идэвхийг нэмэгдүүлдэг болохыг харуулсан бөгөөд энэ нь p38 киназа нь CAR-T эсийн зохицуулалтын гол зохицуулагч болохыг харуулж байна (Gurusamy et al., 2020).
Т эсүүдийг CRISPR/Cas9 ашиглан генетикийн хувьд өөрчилж, өндөр экспресслэгдсэн TCR үүсгэж болно. Генетикийн хувьд өөрчлөгдсөн Т эсүүдийг өвчтөнд шилжүүлэх нь эндоген Т эсүүдээс илүү хүчтэй хорт хавдрын эсрэг үйлчилгээтэй болохыг харуулсан. Тиймээс эндоген TCR нь өвчтөнүүдэд генетикийн хувьд өөрчлөгдсөн TCR-тэй өрсөлдөж болох бөгөөд энэ нь хорт хавдрын дархлаа эмчилгээний чадавхид нөлөөлж болзошгүй юм. Энэ асуудлыг даван туулахын тулд CRISPR/Cas9 ашиглан хүлээн авагч эсүүдээс эндоген TCR-β-г зайлуулж, дараа нь TCR-β Т эсүүдийг хорт хавдартай өвчтөнүүдэд шилжүүлэх нь эндоген TCR бэлгийн өрсөлдөөнгүйгээр хорт хавдрын эсрэг дархлааны хариу урвалыг илүү сайн харуулж чадна (Fan et al. 2018). Тиймээс CRISPR-ээр өөрчлөгдсөн Т эсүүдээс бусад тохиолдолд TCR нь хэвийн TCR-ээр дамжуулагдсан Т эсүүдээс хавдрын эсрэгтөрөгчид мянга дахин илүү мэдрэмтгий байдаг. Нэмж дурдахад, янз бүрийн лейкемийн үед γδ TCR+ CRISPR-ээр үүсгэгдсэн өөрчлөгдсөн Т эсүүд нь стандарт TCR дамжуулалтаас илүү CD4+ ба CD8+ Т эсүүдийн экспрессийг илүү өндөр харуулдаг (Legut et al., 2018). Тиймээс CRISPR/Cas9-ээр үүсгэгдсэн өөрчлөгдсөн Т эсүүд нь TNBC-г даван туулах үр дүнтэй дархлаа эмчилгээний арга байж болох юм.
Интегрин нь эсийн трансмембрануудад байдаг эсийн наалдацын молекулууд бөгөөд эсийг эсийн гаднах матриц (ECM)-тэй холбохыг дэмждэг (Hamidi and Ivaska, 2018). Интегринүүдийн зохицуулалтын алдагдал нь эсийн гаднах матрицыг өөрчлөх замаар хорт хавдрын хөгжил, шилжилт хөдөлгөөнтэй холбоотой бөгөөд энэ нь цусны эргэлтэнд хорт хавдрын эсийн амьдрах чадварыг бууруулдаг (Hamidi and Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-зуучлалтай интегринийг дарангуйлах нь TNBC-д хавдрын өсөлт, үсэрхийлэл, колоничлолыг удаашруулдаг. Интегрин a5 (ITGA5)-ийг дарангуйлах нь уушгины хорт хавдар зэрэг бусад хорт хавдрын эсийн шилжилт хөдөлгөөн, явцыг бууруулдаг болохыг мэдээлсэн (Ju et al., 2017), энэ нь интегрин a5 нь TNBC-ийн эмгэг жамын гол хүчин зүйл байж болохыг харуулж байна.
Уламжлалт үр хөврөлийн үүдэл эсийн (ES) аргыг ашиглан нокаут хулгануудыг үүсгэх нь хөдөлмөр их шаарддаг, цаг хугацаа их шаарддаг, үр ашиггүй үйл явц юм. Гомологийн рекомбинациар дамжуулан ES эсүүдийг онилж, химер хулгануудыг үржүүлж, дараа нь гетерозигот хулгануудтай эрлийзжүүлж гомозигот үр удам гаргахад хэдэн сар, жил шаардагдана. Олон генетикийн мутацитай хулгануудыг бий болгохын тулд нарийн төвөгтэй эрлийзжүүлэлт шаардлагатай. Гэсэн хэдий ч CRISPR/Cas9 ашиглан ES эсийг абляци хийх эсвэл CRISPR/Cas9 бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг нэг эсийн үр тогтсон өндгөн эсэд бичил тарилга хийх замаар үүссэн хулгануудыг ашиглахад олон асуудал үүссэн. Жишээлбэл, өөрчлөлтийг нэвтрүүлэх нь ихэвчлэн хоёр аллелийн локус дээр явагддаг бөгөөд генийн өвөрмөц биш юм. Саяхан CRISPR/Cas9 технологийг ашигладаг ES эсүүд нь 5 хүртэлх генд хоёр аллелийн мутацийг нэгэн зэрэг оруулж чаддаг гэж мэдээлсэн (Нишизоно нар, 2021). Энэ зорилгоор Cas9 мРНХ болон генийн өвөрмөц таван гРНХ-ийг нэгэн зэрэг ES эсүүдэд трансфекц хийсэн. Энэ нь энэхүү процедурын ирээдүй, үр нөлөөг онцолж байгаа боловч эдгээр мутаци нь таван удаагийн нокаут хулганыг бий болгохын тулд үүсгэн байгуулагч шугамыг үржүүлэхэд дамжуулсан байж болзошгүй юм. Судалгаанд мөн гайхалтай нээлтийг мэдээлсэн: ES эсүүд нь генетикийн хувьд өөрчлөгдсөн хулганыг бий болгоход шаардлагагүй болсон. Үүний оронд тодорхой генийн бүтээгдэхүүнийг зайлуулахын тулд Cas9 mRNA болон gRNA-г нэг эсийн үе шаттай үр хөврөлд тарьсан. Үүний үр дүнд хулганад генийн устгалын үр дагаврыг судлахад онолын хувьд ашиглаж болох нокаут үүсгэн байгуулагч шугамуудыг бий болгосон (Qin et al., 2016). Тиймээс CRISPR/Cas9 нь уламжлалт генийн инженерчлэлээс хямд өртгөөр TNBC-г эмчлэх трансген хулгануудыг бий болгох боломжийг олгодог. CRISPR/Cas системийг ашиглан TNBC-д нэг буюу хэд хэдэн эндоген генд цэгийн мутацийг амжилттай нэвтрүүлж чадах шинэ нокаут хулганы загварыг боловсруулсан. Энэхүү концепц дээр үндэслэн TNBC-ийн амьтны загваруудыг CRISPR/Cas9-ээр зуучлагдсан BRCA1 болон p53-ийг устгах замаар боловсруулж болох бөгөөд энэ нь зүрхний цохилтын нөхөн сэргээлт алдагдах, геномын тогтворгүй байдал, мутант фенотип үүсэхэд хүргэдэг (Annunziato et al., 2020).
Одоогийн байдлаар хөхний хорт хавдрын эсийг оношлоход маммографи, соронзон резонансын дүрслэл (MRI), хэт авиан шинжилгээ зэрэг янз бүрийн аргуудыг ашиглаж байна. Гэсэн хэдий ч эдгээр аргууд нь зарим хязгаарлалттай байдаг. Маммографийг хорт хавдрын эсүүд бусад эрхтэн рүү шилжсэн метастаз биш харин орон нутгийн хөхний эдийг оношлоход ашигладаг. Хэт авиан шинжилгээ нь хөхний хорт хавдрын эсийг оношлох найдвартай арга биш юм (Chen and Lee-Felker, 2023). MRI нь хэт авиан болон маммографиас илүү өндөр мэдрэмжтэй боловч оношлогооны нарийвчлал нь хязгаарлагдмал байдаг (Sha and Chen, 2022). Эдийн биопси нь хорт хавдрын эсийг тодорхойлох инвазив арга юм. Гэсэн хэдий ч зарим тохиолдолд зүү нь сонирхлын хэсгээс холдвол биопси нь хорт хавдрын эдийг алдаж болзошгүй. Үүнээс гадна, энэ нь маш үнэтэй бөгөөд өвчтөнд гэмтэл учруулж болзошгүй юм. Хөхний хорт хавдрын эс нь олон төрлийн хорт хавдар тул биопси нь хорт хавдрын хэлбэрийн талаар хангалттай мэдээлэл өгөхгүй байж магадгүй юм. Тиймээс хөхний хорт хавдрын эсийг илрүүлэх оношлогооны хувьд найдвартай шинэ аргыг яаралтай авах шаардлагатай байна. CRISPR/Cas9 нь хөхний хорт хавдрын оношлогоонд маш мэдрэмтгий, хамгийн бага инвазив хувилбар болж чадна. Үүний тулд CRISPR/Cas9 дээр суурилсан стратегиудыг TNBC-ийн оношлогооны PCR аргуудыг сайжруулахад ашиглаж болно. Нэгдүгээрт, CRISPR системийн Cas9 болон cpf1 уургуудыг өвөрмөц бус ДНХ-ийг арилгахад ашигладаг бөгөөд дараа нь эдгээр хоёр уураг (Cas9 болон cpf1) нь зорилтот ДНХ-тэй холбогдохоосоо өмнө PAM дарааллыг таньж чаддаг (Deepak Singh et al., 2021). Тиймээс PCR нь хорт хавдрын хөгжилтэй холбоотой мутацийг тодорхойлж чаддаг. Хэд хэдэн судалгаагаар янз бүрийн хорт хавдрын янз бүрийн мутацийг илрүүлэхийн тулд энэхүү CRISPR дээр суурилсан стратегийг хэрэгжүүлсэн (Safari et al., 2019). Тиймээс CRISPR дээр суурилсан PCR аргууд нь TNBC-ийн оношлогооны биопси дээр суурилсан иммуногистохими зэрэг инвазив аргуудаас хамаарлыг бууруулж болзошгүй юм.
TNBC-д дааврын рецепторын зохицуулалтын генотипийн өөрчлөлтийг мөн харуулсан (Chen and Russo, 2009). Эмчилгээний цэгийн оношилгоонд бичил массив ашигладаг CRISPR/Cas9 дээр суурилсан PCR стратеги нь эдгээр мутацийг үр дүнтэй хянах боломжтой (Hajian et al., 2019). Энэ нь мөн эрүүл мэндийн үйлчилгээ үзүүлэгчдэд TNBC өвчтөнүүдийн тодорхой мутацийн талаар холбогдох мэдээллээр хангаж, тэдний эмчилгээний явцыг сайжруулахад тусалж чадна. Гэсэн хэдий ч энэхүү хосолсон арга нь хязгаарлалттай. Тиймээс энэхүү CRISPR/Cas-PCR аргыг TNBC-ийн оношлогоонд эрүүл мэндийн салбарт ашиглахаас өмнө өргөн хүрээтэй судалгааны ажил шаардлагатай байна (Yang et al., 2019).